高遷移率族蛋白B1與急性胰腺炎腸黏膜屏障損傷關系的研究*

張偉杰 徐桂芳 田志強 吳國忠 鄒曉平#

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院急診科1(210008) 消化科2 中國人民解放軍第101醫院普外科3

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種高度保守的DNA結合蛋白，主要由巨噬細胞、單核細胞在炎癥因子的刺激下主動釋放，亦可由壞死細胞被動釋放，與炎癥反應關系密切［1］。近年研究［2］顯示 HMGB1在壞死型急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)大鼠腸黏膜屏障損傷過程中發揮重要作用。對于HMGB1在臨床實踐中的應用價值，目前尚缺乏深入研究。本研究通過觀察AP患者的血清HMGB1含量及其與血清內毒素含量、二胺氧化酶(DAO)含量、尿液乳果糖/甘露醇(L/M)比值等腸黏膜屏障功能相關指標的關系，分析HMGB1在AP患者腸黏膜屏障損傷中的作用。

對象與方法

一、研究對象

納入2007年12月～2009年3月南京大學醫學院附屬鼓樓醫院和中國人民解放軍第101醫院收治、確診的AP患者80例。根據我國2007年重癥急性胰腺炎(SAP)診治指南［3］將患者分為SAP組和輕癥急性胰腺炎(MAP)組。SAP組患者38例，其中男18例，女20例，年齡23～89歲，平均(51.7±15.7)歲;MAP組患者42例，其中男26例，女16例，年齡19～80歲，平均(37.3±17.8)歲。排除標準:①入院后1 d內死于復蘇失敗者;②結締組織病患者;③腫瘤患者;④合并其他可能影響HMGB1水平疾病者。患者入院后接受抑酶、抑酸、抗感染等常規治療。選取30名同期健康體檢者作為正常對照組，其中男16名，女14名，年齡21～69歲，平均(41.6±10.3)歲。研究方案經南京大學醫學院附屬鼓樓醫院和中國人民解放軍第101醫院倫理委員會批準，所有入組受檢者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.血清HMGB1含量測定:所有入組患者在起病72 h內采集外周血標本5 mL，標本采集后3 h內分離血清并于－20℃保存待測。人HMGB1 ELISA試劑盒為日本SHINO-TEST公司產品，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

2.血清內毒素含量測定:內毒素鱟試劑盒為上海伊華醫學科技有限公司產品。在16孔板中分別加入50 μL去內毒素水，將標準品按1∶3比例稀釋使之濃度達到3 ng/mL，在第一孔內加入25 μL稀釋標準品，充分混勻，再從第一孔內吸出25 μL加入第二孔，依次稀釋至第七孔。從第七孔內吸出25 μL棄去，第八孔作為空白對照。同時做復管，于405 nm波長處測定吸光度(A)值，繪制標準曲線。每孔內加入50 μL血清樣品和50 μL鱟試劑，室溫孵育30～45 min，加入50 μL終止液。于405 nm波長處測定 A值，從標準曲線中得到相應內毒素濃度。

3.血清DAO含量測定:人DAO ELISA試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司。血清樣品于37℃孵育30 min，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液3 mL、辣根過氧化物酶0.1 mL(4 μg)、鄰聯二茴香胺甲醇0.1 mL(500 μg)、鹽酸腐胺 0.1 mL(157 μg)，標準管中加DAO標準品3.8 mL，磷酸鹽緩沖液3.8 mL CT作空白對照，于436 nm波長處測定血清DAO含量。

4.尿液L/M比值測定:采用離子色譜法，乳果糖和甘露醇標準品為美國Sigma公司產品。受檢者空腹8 h，予2 g乳果糖和1 g甘露醇口服，收集6 h尿液，取其中20 mL于－20℃保存待測。取待測尿液樣品5 mL，離心10 min取上清，以去離子水將標本稀釋100～200倍，加入1 g陽離子交換樹脂中去除離子。濾液經孔徑為0.22 μm的濾膜去除蛋白和顆粒后，取25 μL注入高壓液相離子色譜儀，使用配套軟件對色譜圖形進行積分處理，測得峰面積，并建立乳果糖和甘露醇的標準計算公式，計算出樣品中的乳果糖和甘露醇濃度、排出率、L/M比值。

5.AP病情嚴重程度評估:根據相應標準評估入組患者的Ranson評分、24 h APACHEⅡ評分和Balthazar CT評分。

三、統計學分析

結 果

一、血清HMGB1含量

SAP組和MAP組血清HMGB1含量與對照組相比明顯升高，且SAP組明顯高于MAP組，差異均有統計學意義(見表1)。

二、血清內毒素含量、DAO含量和尿液 L/M比值

SAP組和MAP組血清內毒素含量、DAO含量和尿液L/M比值與對照組相比明顯升高，且SAP組明顯高于MAP組，差異均有統計學意義(見表1)。

三、血清HMGB1含量與AP嚴重程度的相關性

線性相關分析顯示，80例AP患者血清HMGB1含量與Ranson評分、24 h APACHEⅡ評分、BalthazarCT評分均呈正相關(r1=0.690，r2=0.840，r3=0.738，P ＜0.001)(見圖1)。

表1 各組血清HMGB1、內毒素、DAO含量和尿液L/M比值比較()

表1 各組血清HMGB1、內毒素、DAO含量和尿液L/M比值比較()

*與 SAP組比較，P ＜0.05;#與 MAP組比較，P ＜0.05

組 別 例數 HMGB1(μg/L) 內毒素(EU/L) DAO(U/L) L/M 比值SAP 組 38 11.79 ±3.98 0.77 ±0.26 18.36 ±6.39 0.39 ±0.26 MAP 組 42 5.38 ±2.06* 0.59 ±0.16* 9.79 ±4.26* 0.18 ±0.19*對照組 30 1.87 ±1.47*# 0.05 ±0.01*# 2.27 ±0.67*# 0.03 ±0.01*#

四、血清HMGB1含量與血清內毒素含量、DAO含量和L/M比值的相關性

線性相關分析顯示，80例AP患者血清HMGB1含量與血清內毒素含量、DAO含量、尿液L/M比值均呈正相關(r1=0.634，r2=0.692，r3=0.686，P＜0.001)(見圖2)。以 HMGB1為自變量，以內毒素、DAO、L/M為應變量行直線回歸，得出HMGB1含量與內毒素含量、DAO含量、L/M比值之間存在線性依存關系(b1=0.366，b2=0.287，b3=0.354，P ＜0.05)。

討 論

AP是臨床常見的急腹癥，腸黏膜屏障損傷引起繼發感染是AP患者死亡的主要原因之一。研究［4］發現，SAP患者早期即存在腸道通透性改變，腸道細菌通過腸黏膜屏障易位至胰腺及其周圍臟器，導致多器官功能衰竭綜合征(MODS)，并釋放內毒素進入血循環，繼發全身性膿毒血癥。Liu等［5］的研究發現，AP患者血清內毒素水平較正常人明顯升高，升高程度與腸道通透性呈正相關。DAO是存在于小腸黏膜上皮細胞內的高活性結構酶，腸黏膜上皮細胞損傷時釋放入血，其在血液中的含量可反映腸黏膜上皮細胞的損傷程度。甘露醇和乳果糖在生理情況下不被機體代謝，主要以原形從尿液排出。乳果糖由腸黏膜細胞間的緊密連接透過腸黏膜，而甘露醇由腸黏膜細胞膜上的水溶性微孔透過腸黏膜。如腸黏膜細胞間緊密連接受損、細胞間隙增大，則乳果糖吸收增加，甘露醇則無明顯變化，因此尿液L/M比值可反映腸黏膜損傷程度［6，7］。本研究發現，SAP和MAP組患者血清內毒素含量、DAO含量、尿液L/M比值與正常對照組相比均顯著升高，提示SAP和MAP患者腸黏膜受損，黏膜屏障通透性增高。

圖1 血清HMGB1含量與AP嚴重程度的相關性

圖2 血清HMGB1含量與腸黏膜屏障功能相關指標的相關性

HMGB1是一種存在于細胞核內的非組蛋白核蛋白，具有晚期炎癥因子的作用，可介導持續性炎癥反應，并參與 DNA 的轉錄、復制、修復等［1，8］。Luan等［2］的研究表明，AP大鼠腸黏膜中HMGB1含量明顯升高，并伴有內毒素、DAO、髓過氧化物酶(MPO)含量升高。Sappington等［9］的研究表明，HMGB1通過誘導誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達促進NO合成，使腸道通透性增加。Yang等［10］的研究顯示，內毒素血癥小鼠的肝臟Kupffer細胞可分泌HMGB1至膽汁中，此種含HMGB1的膽汁可破壞腸黏膜屏障，促進腸道菌群易位。沈美琴等［11］對33例SAP和38例MAP患者的臨床研究發現，患者血清HMGB1水平在發病24 h內開始增高，48 h內達峰值后開始下降，至72 h仍維持在高于正常值的水平。因此本研究在患者發病72 h內采集外周血標本，觀察患者血清HMGB1含量的變化。

本研究結果顯示，MAP組患者血清HMGB1含量顯著高于正常對照組，SAP組顯著高于MAP組，患者血清 HMGB1含量與 Ranson評分、24 h APACHEⅡ評分以及Balthazar CT評分呈正相關，提示血清HMGB1含量可反映AP病情嚴重程度，與既往研究結果相符［12］。此外，本研究還發現血清HMGB1含量與血清內毒素含量、DAO含量、尿液L/M比值呈正相關，且HMGB1含量與內毒素含量、DAO含量、L/M比值之間存在線性依存關系，提示HMGB1可作為判斷AP患者腸黏膜屏障損傷的參考指標。

因此，有望通過拮抗HMGB1保護AP患者的腸黏膜屏障，減少內毒素等物質的吸收和細菌易位，從而減少MODS的發生，改善AP患者的預后。然而，HMGB1具體通過何種機制影響腸黏膜屏障功能目前尚不清楚，需進一步深入研究。

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