硫辛酸對黃羽肉雞生長性能、抗氧化能力和免疫功能的影響

規模化、集約化養殖為肉雞生產做出重要貢獻的同時，也帶來了嚴重的隱患，如肉雞體內產生大量自由基、發生氧化應激，表現為免疫機能低下、疾病易感性增加等［1］。生長期是肉雞機體的各項功能趨于完善的重要時期。因此，提高生長期肉雞抗氧化能力和免疫功能對減少集約化養殖下肉雞疾病的發生以及藥物的使用具有重要的意義。抗氧化劑，作為自由基的清除劑，可以協助體內維持氧代謝平衡，提高機體抗氧化能力，同時維持重要免疫細胞的功能和結構完整性，進而增強機體的免疫機能［2－3］。硫辛酸，是唯一兼具脂溶性與水溶性的的抗氧化劑，具有很強的抗氧化活性，它可以通過螯合金屬離子、清除自由基、再生內源性抗氧化劑來減緩或修復氧化損傷，也被稱為“萬能抗氧化劑”［4］。目前國內外關于硫辛酸的研究主要集中在人類疾病等的治療和預防方面，有關硫辛酸在畜禽飼養和免疫方面的研究報道還較少［5－6］。為此，本試驗以21日齡黃羽肉雞為試驗動物，旨在通過研究硫辛酸對其生長性能、抗氧化能力及免疫功能的影響，為硫辛酸在肉雞生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與材料

試驗選用21日齡體重相近的矮腳黃羽肉雞60只，隨機分成2組，每組5個重復，每個重復6只雞。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組(硫辛酸組)飼喂在基礎飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸的試驗飼糧，試驗期30 d。

硫辛酸由江蘇省常熟市富士萊醫藥化工有限公司提供，純度為99%。

矮腳黃羽肉雞由上海農業科學院畜牧獸醫研究所試驗場提供。

試驗基礎飼糧參照美國NRC(1994)家禽營養需要量配制，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 12 000 IU，VD31 000 IU，VE 60 mg，VB23.0 mg，VB1215 μg，煙酸 nicotinic acid 30 mg，葉酸 folic acid 0.55 mg，生物素 biotin 0.15 mg，泛酸 pantothenic acid 10 mg，膽堿 choline 400 mg，Fe 80 mg，Mn 60 mg，Cu 8 mg，Zn 40 mg，Se 0.15 mg，I 0.7 mg。

2)計算值 Calculated values。

1.2 飼養管理

試驗雞采用舍內籠養方式，自由采食和飲水。按正常程序防疫和雞舍消毒。

1.3 樣品采集與制備

1.3.1血液的采集與樣品制備

分別于試驗第15天和第30天，每個重復挑選與該重復平均體重相近的肉雞1只，翅靜脈采集2管(不含肝素鋰和含肝素鋰)分別為3 mL的血樣，其中不含肝素鋰血樣于3 000 r/min離心15 min制備血清，放入EP管中，置于4℃冰箱保存，用于血清抗氧化指標及免疫指標的測定;含肝素鋰血樣為抗凝血，用于淋巴細胞轉化率的測定。1.3.2 免疫器官采集

分別于試驗第15天和第30天，每個重復挑選與該重復平均體重相近的肉雞1只，屠宰，收集脾臟、胸腺和法氏囊，稱重，用于計算免疫器官指數。

1.4 測試指標和方法

1.4.1 生長性能

試驗期間每天記錄雞只死亡情況，以重復為單位記錄每日投料量和剩余料量，分別于試驗第15天和第30天09:00對試驗雞(禁食12 h)進行稱重，并計算各組死亡率、平均采食量、平均日增重和料重比。

1.4.2 抗氧化能力

血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)活性、總超氧化物歧化酶(T－SOD)活性、總抗氧化能力(TAOC)以及丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量、過氧化氫(H2O2)含量、抑制羥自由基(·OH)能力均使用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。

1.4.3 免疫功能

1.4.3.1 免疫器官指數

免疫器官指數(g/kg)=免疫器官重量(g)/

肉雞活體重(kg)。1.4.3.2 外周血淋巴細胞轉化率

將抗凝血先用無鈣鎂Hank’s液作1∶1稀釋，然后移取3 mL人淋巴細胞分離液于10 mL離心管中，沿管壁緩慢加入2倍體積的稀釋血液，2 500 r/min離心 30 min。取中間白細胞層約1 mL，加入3～5倍 RPMI－1640完全培養液，洗滌3次，每次2 000 r/min離心10 min，棄上清。將190 μL的淋巴細胞懸液加入到96孔細胞培養液中，再加入含10 μL的伴刀豆球蛋白A(ConA)或10 μL的脂多糖(LPS)溶液，每個樣品3個重復，每個樣品留2個孔作空白對照，培養體系每孔共200 μL。于 5%CO2、39 ℃ 下培養 72 h。在培養結束前4小時，每孔加5 mg/mL噻唑藍(MTT)10 μL，繼續培養，培養結束時，每孔再加入100 μL 10%十二烷基磺酸鈉(SDS)－0.04 mol/L氯化氫(HCl)溶液，30 min后用酶標儀在570 nm波長下測定OD值。淋巴細胞轉化率=絲裂原刺激孔OD570nm/

對照孔OD570nm。

1.4.3.3 血清免疫球蛋白

血清免疫球蛋白 A(IgA)、免疫球蛋白 M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量均采用免疫比濁法進行測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數據處理

采用 SPSS 13.0軟件的 One－way ANOVA程序對試驗數據進行方差分析，分別以P＜0.05、P＜0.01作為差異顯著與極顯著的判斷標準，結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 硫辛酸對黃羽肉雞生長性能的影響

由表2可以看出，與對照組相比，硫辛酸對2個階段的黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比均無顯著影響(P＞0.05)。

表2 硫辛酸對黃羽肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of lipoic acid on growth performance of yellow－feathered broilers

同行同一階段中的數據肩注小寫字母不同表示差異顯著(P＜0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P＜0.01)，無肩注表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values in the same period with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P＜0.01)，while without letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 硫辛酸對黃羽肉雞抗氧化能力的影響

由表3可見，在試驗第15天時，與對照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞血清 T－SOD活性升高了19.57%(P＜0.05)，NO含量下降了 16.64%(P＜0.05)。

在試驗第30天時，與對照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞血清抑制羥自由基能力提高了562.56%(P＜0.01)，MDA含量降低了20.98%(P＜0.05)。

2.3 硫辛酸對黃羽肉雞免疫器官指數的影響

由表4可以看出，在試驗第15天時，與對照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞脾臟指數提高了29.86%(P＜0.05)。

在試驗第30天時，與對照組相比，硫辛酸對黃羽肉雞脾臟指數、胸腺指數、法氏囊指數均無顯著影響(P＞0.05)。

2.4 硫辛酸對黃羽肉雞外周血淋巴細胞轉化率的影響

由表5可知，在試驗第15天時，與對照組相比，硫辛酸對由ConA和LPS刺激的黃羽肉雞外周血淋巴細胞轉化率均無顯著影響(P＞0.05);在試驗第30天時，二者分別提高了16.83%和19.79%(P＜0.05)。

2.5 硫辛酸對黃羽肉雞血清免疫球蛋白含量的影響

由表6可以看出，在試驗第15天時，與對照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞血清IgG含量提高了34.03%(P＜0.01)。

在試驗第30天時，與對照組相比，硫辛酸組黃羽肉雞IgG含量提高了29.40%(P＜0.05)。

3 討論

3.1 硫辛酸對黃羽肉雞生長性能的影響

Zhang等［7］研究表明，飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對愛拔益加肉雞生長性能無顯著影響(P＞0.05)，這與本試驗結果一致。Srilatha等［8］研究也發現，飼糧中添加20、40、60 mg/kg硫辛酸對肉雞日增重、料重比均無顯著影響(P＞0.05)。在本試驗中，飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對整個試驗期間黃羽肉雞平均日采食量、平均日增重、料重比均無顯著影響(P＞0.05)，這與已有研究結果相似。

表3 硫辛酸對黃羽肉雞血清抗氧化能力的影響Table 3 Effects of lipoic acid on serum antioxidant capacity in yellow－feathered broilers

表4 硫辛酸對黃羽肉雞免疫器官指數的影響Table 4 Effects of lipoic acid on immune organ indices in yellow－feathered broilers g/kg

表5 硫辛酸對黃羽肉雞外周血淋巴細胞轉化率的影響Table 5 Effects of lipoic acid on lymphocyte transformation rate in peripheral blood in yellow－feathered broilers

3.2 硫辛酸對黃羽肉雞抗氧化能力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是機體清除自由基的一種重要酶，T－SOD活性的高低間接反映了機體清除自由基的能力。GSH－Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物酶，它能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構和功能不受過氧化物的干擾及損害。脂質過氧化最終產物之一是MDA，血清中MDA含量的高低間接反映了機體細胞受到自由基攻擊的嚴重程度。試驗動物在服用抗氧化劑一段時間后，可以通過測定血清或組織中SOD活性、GSH－Px活性、MDA含量等的變化來判斷抗氧 化劑的作用效果［9］。

表6 硫辛酸對黃羽肉雞血清中免疫球蛋白含量的影響Table 6 Effects of lipoic acid on serum immunoglobulin content in yellow－feathered broilers μg/mL

目前，硫辛酸的抗氧化功能已經得到證實。Zhang等［7］研究表明，飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以顯著降低愛拔益加肉雞血清MDA含量(P＜0.01);李建文等［10］研究也發現，肉鴨飼糧中添加150 mg/kg硫辛酸有提高其血漿GSH－Px活性的趨勢(P=0.077)，可以顯著降低其肝臟MDA含量(P＜0.05)。在本試驗第15天時，硫辛酸組黃羽肉雞血清T－SOD活性顯著高于對照組(P＜0.05);在第30天時，硫辛酸組黃羽肉雞血清MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05)，由此可初步判定300 mg/kg硫辛酸可以在一定程度上改善黃羽肉雞機體的抗氧化能力。

隨著現代養殖業集約化程度的提高，動物機體內自由基過量產生，引起脂質、蛋白質氧化損傷，誘導各種疾病的發生。抗氧化劑作為自由基的清除劑，可以抑制或減緩自由基或自由基所產生的連鎖反應化合物的生成，達到修復機體氧化損傷的作用。因此，自由基的水平也從側面反映了抗氧化劑抗氧化能力的強弱［11］。NO作為一種氮自由基，攜帶有1個未配對電子，極易與氧、超氧陰離子、過氧化氫反應生成 NO3－和NO2－。其中NO3－容易質子化后迅速分解成具有高反應性的羥自由基，誘發生物膜的多種不飽和脂肪酸的脂質過氧化作用，造成細胞損傷［12］。在本試驗中，第15天硫辛酸組黃羽肉雞血清NO含量顯著低于對照組(P＜0.05)，表明硫辛酸的添加可以在黃羽肉雞21～35日齡顯著減少NO的產生，進而減緩脂質過氧化作用的發生，保護機體組織不受損傷。羥自由基則是人體在新陳代謝過程中產生的對生物體毒性最強、危害最大的自由基，它可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質、核酸等物質發生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導致細胞損傷、壞死或突變［13］。抑制羥自由基的能力可以間接反映羥自由基的活性，二者之間為反相關系。即抑制羥自由基能力越強，羥自由基活性越弱;抑制羥自由基能力越弱，羥自由基活性越強。在本試驗中，第30天時，硫辛酸組黃羽肉雞血清抑制羥自由基能力顯著高于對照組(P＜0.01)，說明硫辛酸的添加可以顯著降低血清中羥自由基的活性，保護機體免受損傷。

從以上結果可以看出，硫辛酸作為抗氧化劑可以在一定程度上清除機體自由基，提高肉雞抗氧化水平。

3.3 硫辛酸對黃羽肉雞免疫功能的影響

3.3.1 硫辛酸對黃羽肉雞免疫器官指數的影響

脾臟、胸腺、法氏囊作為禽類主要免疫器官，在機體的體液免疫和細胞免疫中發揮了極其重要的作用。脾臟是禽類最大的外周免疫器官，聚居著大量B細胞、T細胞，是免疫應答的重要場所。同時也是體內產生抗體的主要器官，參與全身細胞免疫和體液免疫。胸腺和法氏囊是禽類的中樞免疫器官，前者主要負責T細胞的成熟和分化，后者則是B細胞生長和分化的部位，主要參與體液免疫。中樞和外周免疫器官發育狀態及其機能強弱直接決定著禽類全身的免疫水平［14］。Rivas等［15］認為，脾臟、胸腺及法氏囊的重量可用于評價雛雞的免疫狀態，其絕對重量和相對重量越大，說明機體的細胞免疫和體液免疫機能越強。在本試驗第15天時，硫辛酸可以促進脾臟和胸腺的發育，其中對脾臟發育的影響顯著(P＜0.05)，表明硫辛酸可以在一定程度上促進免疫器官的發育，進而提高機體免疫水平。

3.3.2 硫辛酸對黃羽肉雞細胞免疫的影響

硫辛酸作為唯一一個脂水兼溶的抗氧化劑，在水相和脂質中都有較好的溶解性，可以以相當高的濃度存在于細胞內和細胞外，發揮清除脂溶性和水溶性自由基的作用，從而保護脂蛋白及細胞膜，增強免疫細胞的完整性，進而提高細胞免疫功 能。Srilatha 等［8］發 現，飼 糧 中 添 加 60、80 mg/kg硫辛酸均可顯著刺激肉雞皮膚嗜堿性粒細胞過敏反應(P＜0.05);崔玨等［16］研究也發現，高脂飼糧中添加0.1%硫辛酸可以顯著提高小鼠外周血CD4+/CD8+、B細胞百分含量(P＜0.05)，進而有效改善慢性氧化應激對免疫系統的損傷，這表明飼糧中添加一定量的硫辛酸可以提高動物細胞免疫水平。檢測外周血淋巴細胞轉化率也是細胞免疫研究的一種常用方法。ConA和LPS是常用來檢測外周血淋巴細胞轉化率的絲裂原，作為促分裂因子來檢測淋巴細胞轉化功能，其轉化率的高低常作為衡量機體細胞免疫水平的指標。其中ConA選擇性地刺激T細胞，而LPS只刺激B細胞［17］。在本試驗中，第30天時，硫辛酸組黃羽肉雞由ConA、LPS刺激的外周血淋巴細胞轉化率均顯著高于對照組(P＜0.05)，表明300 mg/kg硫辛酸可以在黃羽肉雞21～35日齡顯著提高其細胞免疫水平。

3.3.3 硫辛酸對黃羽肉雞體液免疫的影響

免疫球蛋白是具有抗體活性或化學結構上與抗體相似的球蛋白，是一類重要的免疫效應分子。家禽主要含有 IgA、IgM、IgG 3種免疫球蛋白。IgA具有抗菌、抗毒、抗病毒作用，占血清免疫球蛋白的10%～20%。IgG是人和動物血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白總量的75%～80%，同時它也是再次免疫所產生的免疫球蛋白，在體液免疫中最為重要。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是初次體液反應早期階段產生的主要的免疫球蛋白，但持續時間短，其含量僅占血清免疫球蛋白的10%左右［18］。在本試驗中，硫辛酸組黃羽肉雞IgG含量在整個試驗期間均顯著高于對照組(P＜0.05)。作為體液免疫中最重要的免疫球蛋白，IgG含量的提高表明飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以增強肉雞體液免疫功能。

4 結論

①飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸對黃羽肉雞的生長性能無顯著影響。

②飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可抑制黃羽肉雞體內自由基的產生，在一定程度上提高機體的抗氧化能力。

③飼糧中添加300 mg/kg硫辛酸可以通過提高黃羽肉雞細胞免疫和體液免疫水平，進而改善其免疫功能。

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