酵母核苷酸對團頭魴生長性能、抗氧化功能和抗病力的影響

張一平 劉 波 華洵璐 孫 梅 謝 駿* 史濟筠

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水魚類遺傳育種和養殖生物學重點開放實驗室，無錫 214081;2.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，無錫 214063;

3.江蘇省宜興市天石飼料有限公司，宜興 214258)

核苷酸是生物體內一類低分子化合物，是構成生物大分子核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)的基本組分，幾乎參與細胞的所有生化過程，具有調節生物體能量代謝、參與遺傳信息編碼、傳遞細胞信號等重要的生理和生化功能［1］。生物體通過從頭合成和補救這2種途徑合成內源核苷酸。從頭合成途徑是由多種小分子如二氧化碳、氨、核糖、甘氨酸、嘌呤和嘧啶等，經一系列酶催化反應逐步組裝而成;補救途徑是以食物吸收和體內核酸分解所提供的堿基為原料，經酶促磷酸化而成。從頭合成是核苷酸合成的主要方式，但需消耗相當高的能量。外源核苷酸除直接提供核苷酸外，還可增加補救途徑的核苷酸生成量，并反饋抑制從頭合成途徑而起到節能作用［2］。研究表明，當動物處于快速生長期、肝功能障礙、免疫應激等特殊生理條件下時，內源核苷酸合成相對不足，此時需要來源于飼料的外源核苷酸加以補充［3］。因此，核苷酸被稱為半必需營養物質或條件營養物質，是一類極有發展前途的新型飼料添加劑［4］。

外源核苷酸可促進動物的生長和提高免疫功能［5－6］已經被證實。王銳等［7－8］在異育銀鯽幼魚飼料中添加500 mg/kg等量混勻的純度≥90%的5種核苷酸——腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、胞苷酸(CMP)、肌苷酸(IMP)、鳥苷酸(GMP)，結果發現，該混合核苷酸能顯著提高異育銀鯽幼魚的增重率和特定生長率，降低飼料系數，改善魚體的脂肪代謝，提高魚體的非特異性免疫功能，同時還能提高魚體中各種消化酶的活性。也有采用有效成分含量為8.6%的酵母核苷酸(具體成分未公布)作為外源添加劑進行研究的。例如:王廣軍等［9］在凡納濱對蝦飼料中添加344 mg/kg時能顯著促進對蝦生長，提高機體抗應激能力和免疫能力;周興華等［10］在錦鯉幼魚飼料中添加387 mg/kg時能顯著提高錦鯉幼魚增重率、特定生長率，降低飼料系數;魏文志等［11］在異育銀鯽飼料中添加344 mg/kg時能顯著促進異育銀鯽的生長，并降低飼料系數，添加172 mg/kg時能顯著提高異育銀鯽血清中溶菌酶和堿性磷酸酶活性。

目前國內肌苷和鳥苷的發酵水平很高，以此為原料合成的IMP和GMP比較便宜［12］;而AMP、UMP、CMP仍只能從酵母中提取，提取成本較高。因此，添加純核苷酸會增加養殖成本，降低養殖戶的經濟效益;而8.6%的酵母核苷酸因有效成分含量低，不便于飼料配方的設計。鑒于此，本試驗擬采用介于兩者之間的第3種劑型，即有效成分含量為70%的酵母核苷酸(具體成分參見材料與方法)，以我國淡水養殖的大宗品種——團頭魴(俗稱武昌魚、鳊魚)為試驗對象，研究該劑型核苷酸對魚體生長性能和抗氧化功能的影響，同時采用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒試驗，研究該劑型核苷酸對魚體抗病力的影響，為核苷酸在水產養殖中的應用提供更進一步的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用酵母核苷酸由江蘇省蘇微微生物研究有限公司提供，從酵母細胞中提取，有效成分含量為 70%(AMP 8.72%、GMP 9.67%、CMP 6.80%、UMP 8.11%、低聚核苷酸36.70%)。

1.2 試驗飼料

基礎飼料參考我國水產行業標準SC/T 1074—2004配制，其組成及營養水平見表1。在基礎飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸(按照受試物的量計算，即1 kg基礎飼料中加入200 mg有效成分含量為70%的酵母核苷酸)作為試驗飼料。各種原料分別粉碎過60目篩，先將磷酸二氫鈣、凹凸棒土、沸石粉、預混料等混勻，再加大料逐級充分混勻，后加適量水，用小型絞肉機制成粒徑為2.0 mm的濕顆粒飼料，晾干備用。

表1 基礎飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)維生素預混料為每千克飼料提供Vitamin premix provided the following per kg of diet:VC 150 mg，VE 100 mg，VK35 mg，VA 2 000 IU，VB110 mg，VB220 mg，VB610 mg，VB120.05 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 100 mg，葉酸 folic acid 5 mg，生物素 biotin 1 mg，肌醇 inositol 500 mg，煙酸 niacin 150 mg。

2)礦物質預混料為每千克飼料提供Mineral premix provided the following per kg of diet:CuSO4·5H2O 52.5 mg，FeSO4·7H2O 28 mg，ZnSO4·7H2O 22 mg，MnSO4·4H2O 9 mg，Na2SeO30.045 mg，KI 0.026 mg，CoCl2·6H2O 0.1 mg。

1.3 試驗動物

試驗用團頭魴由中國水產科學院淡水漁業研究中心漁場提供。選擇健康且規格、重量基本一致的團頭魴300尾，個體初始體重為(31.46±0.07)g。將所選試驗魚隨機分成2組(對照組和核苷酸組)，每組3個重復，每個重復50尾，以重復為單位放養于規格為1.00 m×1.00 m×1.00 m的網箱內。對照組試驗魚飼喂基礎飼料(核苷酸主要來自于魚粉，含量僅為60 mg/kg左右)，核苷酸組試驗魚飼喂試驗飼料(基礎飼料+200 mg/kg酵母核苷酸)。

1.4 飼養管理

試驗在中國水產科學院淡水漁業研究中心無錫南泉試驗基地完成。團頭魴在網箱馴養30 d后開始投喂試驗飼料，投飼率為魚體重的2% ～4%，每天投喂 2次，在 08:00—08:30、16:00—16:30各投喂1次。試驗期間每天08:00和16:00各測水溫1次，每周測1次水質，保持水溫在(25.0±1.5)℃，溶氧≥6 mg/L，氨氮≤0.1 mg/L，pH 6.8～7.0。每天觀察魚攝食及死亡情況，并根據實際情況每隔1周增加投飼量。正式試驗時間為56 d。

1.5 攻毒試驗

飼養試驗結束后，分別從對照組和核苷酸組中選擇大小基本一致的魚30尾進行攻毒試驗，每組分3個重復，每個重復均為10尾魚。病原菌為浙江省淡水水產研究所提供的嗜水氣單胞菌BSK－10株。按王文博等［13］所述方法，將2次活化后的嗜水氣單胞菌用無菌生理鹽水稀釋，使其終濃度約為2×108個/mL。根據每100 g魚腹腔注射菌液1.0 mL的標準進行注射(例如:50 g魚，注射0.5 mL;40 g魚，注射0.4 mL)，注射后以重復為單位放養于容積為200 L的玻璃缸中，并保證充足的氧氣，每天觀察魚體死亡情況，觀察1周，統計不同時間點的累積死亡率。

1.6 指標測定與方法

1.6.1 生長和形體指標的測定

飼養試驗結束后，稱量每個網箱團頭魴總重，以計算生長指標。在每個網箱中隨機抽取3尾魚，量取體長、體重以及肝臟重，以計算形體指標。1.6.2 血液生理生化指標的測定

飼養試驗結束后，每個重復取3尾魚，將魚迅速撈起并立即投入濃度為200 mg/L的3－氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽溶液中快速深度麻醉;將2 mL注射器管壁用肝素潤濕，尾靜脈采血;血樣在4℃冰箱靜置1～2 h，于4℃、3 000 r/min下離心10 min制備血漿，血漿移入－20℃保存備測。

血漿總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(GLU)含量均采用比色法測定，試劑盒購自衛生部上海生物制品研究所;甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)含量均采用酶法測定，試劑盒購自上海名典生物工程有限公司;谷草轉氨酶(GOT)和堿性磷酸酶(AKP)活性均采用比色法測定，試劑盒購自駿實生物科技(上海)有限公司;抗超氧陰離子水平采用比色法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。上述指標均使用美國貝克曼Cx－4型全自動生化分析儀進行測定。

1.6.3 相關指標的計算公式

存活率(SR，%)=100×(初始魚尾數－

死亡魚尾數)/初始魚尾數;攝食率(FR，%/d)=100×干物質攝入量/［試驗天數×(初始體重+終末體重)/2］;

特定生長率(SGR，%/d)=100×(ln初始體重－ln終末體重)/試驗天數;

蛋白質效率(PER，%)=100×(初始體重－

終末體重)/蛋白質攝入量;

飼料系數(FCR)=飼料消耗量/魚體增重量;肝體比(HSI，%)=100×肝臟重/魚體重;內臟比(VSI，%)=100×內臟重/魚體重;肥滿度(CF，%)=100×魚體重/魚體長3;累積死亡率(CMR，%)=100×(初始魚尾數－

終末魚尾數)/初始魚尾數。

1.7 數據統計與分析

所有數據均采用SPSS 11.5統計軟件進行分析處理，采用Student氏t檢驗法比較組間的差異性，P＜0.05表示差異顯著。所有結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 酵母核苷酸對團頭魴生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，核苷酸組的特定生長率和蛋白質效率顯著提高(P＜0.05)，分別比對照組提高了9.52%和14.72%;飼料系數顯著降低(P＜0.05)，比對照組降低了10.99%;攝食率雖有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)。這說明，飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸后能促進魚體生長，提高飼料利用率。

表2 酵母核苷酸對團頭魴生長性能的影響Table 2 Effects of yeast nucleotide on growth performance of buntnose black bream

同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，while with the same small letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 酵母核苷酸對團頭魴形體指標和存活率的影響

由表3可知，與對照組相比，核苷酸組在各項形體指標(肝體比、內臟比、肥滿度)以及存活率上均未發生顯著變化(P＞0.05)，說明飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸后不會造成團頭魴形體的改變，不會影響團頭魴的存活率。

表3 酵母核苷酸對團頭魴形體指標和存活率的影響Table 3 Effects of yeast nucleotide on body indices and survival rate of bluntnose black bream %

2.3 酵母核苷酸對團頭魴血液生理生化指標的影響

2.3.1 酵母核苷酸對團頭魴免疫和抗氧化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，核苷酸組的血漿堿性磷酸酶活性無顯著變化(P＞0.05)，但有微弱的增加(增加幅度為6.97%)。核苷酸組的血漿抗超氧陰離子水平與對照組相比有了顯著提高(P＜0.05)，提高幅度達41.29%，說明飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸能顯著地增強團頭魴的抗氧化功能。

表4 酵母核苷酸對團頭魴免疫和抗氧化指標的影響Table 4 Effects of yeast nucleotide on immune and antioxidant indices of bluntnose black bream U/L

2.3.2 酵母核苷酸對團頭魴肝功能指標的影響

由表5可知，與對照組相比，核苷酸組的各項肝功能指標均未產生顯著變化(P＞0.05)，說明200 mg/kg的酵母核苷酸添加量不影響團頭魴的肝功能。

表5 酵母核苷酸對團頭魴肝功能指標的影響Table 5 Effects of yeast nucleotide on liver function indices of bluntnose black bream

2.3.3 酵母核苷酸對團頭魴血脂和血糖指標的影響

由表6可知，與對照組相比，核苷酸組的血脂和血糖指標均未產生顯著變化(P＞0.05)，說明200 mg/kg的酵母核苷酸添加量不影響團頭魴的血脂和血糖代謝。

表6 酵母核苷酸對團頭魴血脂和血糖指標的影響Table 6 Effects of yeast nucleotide on blood lipid and glucose indices of bluntnose black bream mmol/L

2.4 酵母核苷酸對團頭魴抗病力的影響

*表示與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。* means significant difference compared with the control group(P＜0.05).圖1 酵母核苷酸對嗜水氣單胞菌攻毒團頭魴累積死亡率的影響Fig.1 Effects of yeast nucleotide on cumulative mortality rate of bluntnose black bream challenged with Aeromonas hydrophila

3 討論

3.1 核苷酸對團頭魴生長性能的影響

國內學者已證實了核苷酸對錦鯉［10］、異育銀鯽［11］、梭鱸［14］、斑點叉尾［15］、尖吻鱸［16］等魚種的促生長作用，雖其適宜添加量因配方背景、魚種及核苷酸劑型不同而有很大差異，但一般在100～700 mg/kg范圍內。本文選用團頭魴作為試驗對象，按照酵母核苷酸200 mg/kg的添加量進行試驗，也得到了類似的結果。其作用機理主要是:外源核苷酸能提供魚體快速生長時細胞復制所需的核苷酸［17］;可使代謝酶活性增強，誘導激素或酶的合成［18］;能提高腸道消化酶活性，刺激胰蛋白酶分泌［8］;能使魚類腸皺壁基底膜厚度和腸道表面積增加，腸道折疊高度提高［19］。本文僅設計了200 mg/kg的酵母核苷酸添加量，該添加量是綜合了已有的文獻報道，并結合添加成本等因素決定的，結果表明該添加量能促進團頭魴的生長，但未能得到該劑型核苷酸針對團頭魴的最佳添加量，因此還需要做進一步研究。

3.2 核苷酸對團頭魴免疫功能的影響

外源添加核苷酸能增強魚類的免疫功能，是因為魚體的免疫細胞缺乏通過從頭合成途徑合成核苷酸的能力，必須依靠已經合成好的外源核苷酸［20－21］。向 梟 等［6］研 究 表 明，飼 料 中 添 加519.85～774.00 mg/kg核苷酸能提高鯉魚血清溶菌酶、超氧化歧化酶和過氧化氫酶的活性;王銳等［7］研究表明，飼料中添加500 mg/kg核苷酸能提高異育銀鯽幼魚的非特異性免疫功能;魏文志等［11］研究表明，飼料中添加172 mg/kg核苷酸能提高異育銀鯽血清中堿性磷酸酶和溶菌酶活性。本研究表明，飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸對團頭魴血漿堿性磷酸酶活性雖無顯著影響，但

由圖1可知，在嗜水氣單胞菌攻毒試驗中，在發生應激12 h后，2組試驗魚均開始出現死亡。在12～24 h，對照組試驗魚的累積死亡率明顯高于核苷酸組，且死亡率的增加趨勢也明顯快于核苷酸組;48 h后，核苷酸組累積死亡率不再增加，而對照組累積死亡率的增加一直持續到96 h時。在整個攻毒試驗期間，對照組試驗魚12～168 h的累積死亡率為55.56%～72.22%(平均值為61.66%)，核苷酸組試驗魚12～168 h的累積死亡率為16.671% ～44.44%(平均值為28.33%)。96～168 h的累積死亡率，對照組與核苷酸組之間存在顯著差異(P＜0.05)，說明添加量為200 mg/kg的酵母核苷酸可增強團頭魴對嗜水氣單胞菌感染的抵抗能力。有增加趨勢。本研究結果與上述研究結果存在一定差異，這是否與試驗魚種、飼料組成、試驗條件、核苷酸的劑量及劑型不同有關，還需要進一步研究。

3.3 核苷酸對團頭魴抗氧化功能的影響

動物體內存在有一定數量的超氧陰離子自由基，其不發生化學變化時對動物體無害，但與羥基(—OH)結合后的產物會導致細胞DNA被損壞，進而破壞機體功能。抗超氧陰離子能清除超氧陰離子自由基，使超氧陰離子自由基的產生與消除處于一個動態平衡狀態，從而減少超氧陰離子自由基對機體自身的損傷［9］。本試驗研究表明，飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸顯著提高了團頭魴血漿中抗超氧陰離子水平，說明團頭魴的抗氧化功能得到增強。但關于核苷酸增強團頭魴抗氧化功能的作用機理還不十分清楚，有待進一步深入研究。

3.4 核苷酸對團頭魴形體、肝功能以及血脂和血糖指標的影響

目前，國內外關于核苷酸的研究多集中于其對動物生長性能、免疫功能、應激、消化功能和體組成方面的影響。本文針對核苷酸對團頭魴形體(主要為肝體比、內臟比、肥滿度)以及肝功能、血脂和血糖指標的影響進行了初探性研究，結果表明飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸對上述指標均未產生顯著影響。核苷酸是生物體內本身含有的物質，不被生物體排斥。有學者認為，動物攝入過多的核酸類物質會造成核酸代謝紊亂，血液中尿酸濃度上升，引起痛風病［2］;但也有學者認為，魚類肝臟中含有較高濃度的尿酸酶，可將尿酸轉化為尿囊素，再降解為尿素和乙醛酸并從尿中排泄出去，所以能耐受較高劑量的核苷酸［1］。關于魚類飼料中核苷酸的添加量到底多少才合適，還需要做更詳細地試驗，本研究的結果僅證明酵母核苷酸200 mg/kg的添加量不會影響團頭魴的形體發育、肝功能以及血脂和血糖代謝。

3.5 核苷酸對團頭魴抗病力的影響

核苷酸作為免疫增強劑，通過刺激水生動物非特異性免疫反應達到預防傳染性疾病的目的［22－24］。本研究通過對團頭魴進行嗜水氣單胞菌攻毒試驗，證明飼料中添加200 mg/kg酵母核苷酸能明顯降低團頭魴的累積死亡率;并且核苷酸組的累積死亡率延續時間明顯比對照組縮短(大約縮短了48 h)，這種時間上的縮短可能與外源添加核苷酸后使團頭魴的免疫功能和抗病力迅速增強有關。國外有研究用鰻弧菌、傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、鮭魚立克次體、海洋寄生蟲分別感染大西洋鮭魚，結果發現飼料中添加300 mg/kg核苷酸能顯著降低大西洋鮭魚的累積死亡率［25］。本研究所得結果與國外的研究結果是相近的，至于添加量的差異，可能與試驗魚種、飼料組成和試驗條件不同有關，還需要進一步研究。

3.6 關于酵母核苷酸劑型的選擇

將5種純核苷酸(純度≥90%)等量混合的劑型，其中的AMP、UMP、CMP需從酵母核酸的酶解液中經繁瑣的提取工藝才能得到，生產成本較高，增加了添加成本;而8.6%酵母核苷酸劑型，不需經過核苷酸的提純工藝，生產成本低廉，但有效成分含量低，影響養殖效果，也不便于飼料配方的設計。本研究采用的是有效成分(單體核苷酸+低聚核苷酸)含量達70%的酵母核苷酸，其中含有的低聚核苷酸被認為具有特殊的生理保健功效［26］，其生產成本介于前2種劑型之間。但究竟何種劑型既能使養殖效果最好，又能使經濟效益最顯著，還需進行更詳細的對比研究。

4 結論

飼料中添加200 mg/kg的酵母核苷酸能在一定程度上促進團頭魴的生長，增強魚體的抗氧化功能和抗病力，且不會影響魚體肝功能以及血脂和血糖代謝。

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