功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃發酵及微生物生長效率的影響

戈婷婷 瞿明仁 張 暉 黎觀紅 鐘志勇 劉光斌

(江西農業大學，南昌 330045)

功能性寡糖也叫非消化性寡糖(NDOS)，是指不被人和動物腸道吸收，并能促進有益菌的增殖，有益于腸道健康的一類寡糖。功能性寡糖被認為是一種具有多種功能的營養生理活性物質，由于其難以被動物體內分泌的消化酶分解，因此在畜牧業中被看作是一種很有開發潛力的綠色飼料添加劑。寡糖作為新型的飼料添加劑，是近年來國內外學者關注的熱點。許多報道已表明功能性寡糖能提高豬、家禽和水產動物的生產性能［1－2］，增強其免疫力［3－4］，降低消化道的發病率［5－6］。對于反芻動物，功能性寡糖也能降低其胃腸疾病發生率，改善反芻動物瘤胃微生物區系［7］，提高胃腸道對食糜的消化率［8］，提高反芻動物的免疫功能［9］。但是目前有關功能性寡糖的研究主要集中在單胃動物上，對反芻動物的研究報道較少，在較少的關于反芻動物的研究又大都集中在對瘤胃的單個發酵參數，而沒有從瘤胃微生物方面深入研究。本試驗以南方的地方品種錦江黃牛為研究對象，以甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖為研究材料，采用體外批次培養法，探討功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃微生物發酵的影響，建立瘤胃微生物生長效率模型，為功能性寡糖在反芻動物生產中的應用提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、飼糧及飼養管理

選用3頭體重為(300±15)kg安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛，以供瘤胃液的采集。試驗動物每天飼喂2次(08:00和18:00)，自由飲水。基礎飼糧為玉米－麥麩－稻草型，精粗比為20∶80，基礎飼糧組成及營養水平見表1。試驗預飼期14 d，第15天開始采集瘤胃液供體外培養。體外批次培養底物組成與瘤胃液供體牛飼糧組成完全相同。甘露寡糖購自北京奧特奇生物制品有限公司，其有效成分含量大于90%;果寡糖購自河北維爾康制藥有限公司，其有效成分含量大于92%;大豆寡糖購自陜西森弗生物技術有限公司，純度為98%。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)每千克預混料含 One kilogram of premix contained the following:VA 500 kIU，VD380 kIU，VE 2 000 IU，煙酸nicotinic acid 80 g，Cu 2 g，Fe 10 g，Mn 8 g，Zn 6 g，Se 0.02 g，I 0.1g，Co 0.02 g。

2)營養水平值為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 試驗設計

試驗采用體外批次培養法。體外批次培養裝置參照盧德勛等［10］和程茂基［11］的方法進行。該裝置主體為恒溫水浴搖床，其水浴溫度和震蕩速率可調。培養瓶為瓶口安裝有橡皮塞的150 mL奶瓶，橡皮塞上接有帶三通閥的橡膠管，三通閥可打開和關閉，三通閥一端與30 mL醫用玻璃注射器相連，注射器用于測定體外培養過程中的產氣量。

于晨飼前由3頭錦江黃牛瘤胃內上下左右(背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊)不同位點采集足量瘤胃液，灌入經預熱達39℃并通有CO2的滅菌清潔燒杯中，燒杯置于裝有39℃蒸餾水的保溫瓶中，灌滿后立即蓋好保溫瓶蓋子，迅速返回實驗室，經4層紗布過濾后持續通入CO2氣體5 min，然后迅速分裝至已預熱好并裝有培養底物(基礎飼糧2 g)和人工培養液(20 mL)的培養瓶內，每個培養瓶加20 mL瘤胃液。接通培養瓶，打開振蕩開關，開始培養。

根據培養底物中甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖添加水平的不同，分別設為4個組，各組功能性寡糖添加量分別為0(對照組)、0.80%、1.00%和1.20%，每組設4個重復。

1.3 樣品的采集與分析

培養24 h后采集樣品，立即用pH計測定pH。將培養物用紗布過濾，濾渣無損失地轉移入100 mL大坩堝中，置于65℃烘箱中烘干，以測定可消化有機物質(DOM)的含量。濾液轉移至100 mL大離心管中，1 500 r/min離心 15 min，去除原蟲和飼料大顆粒。取10 mL離心上清液用三氯乙酸沉淀法測定菌體蛋白(BCP)濃度［12］;微生物氮產量(daily microbial nitrogen production，DMNP)的計算由測得的BCP濃度除以6.25即得。

微生物生長效率(rumen microbial growth efficiency，MOEFF)=微生物氮產量/

可消化有機物質。

另取10 mL上清液，－20℃保存，以測定揮發性脂肪酸(VFA)，VFA的測定采用GC－1690氣相色譜儀(杭州科曉化工儀器設備有限公司)FID檢驗器，OV－1701型毛細管(30 m×0.32 mm×0.5 μm)，2000色譜數據工作站，內標分析法，內標物為巴豆酸。采用程序升溫，初溫80℃，初時3.5 min，升速 30 ℃/min，終溫 180 ℃，終時10 min;進樣室溫度260℃，檢測器溫度260℃;柱前壓力0.05 MPa，氮氣作為載氣。樣品進樣量1 μL。

1.4 統計分析

基本數據處理采用Excel 2003，試驗結果分析采用SPSS 13.0中的One－way ANOVA程序進行方差分析，多重比較用Duncan氏法，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 不同功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃微生物體外發酵參數的影響

2.1.1 不同功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃液pH的影響

在體外培養的整個過程中，瘤胃液pH均在6.50～7.00之間，符合瘤胃微生物生長的正常范圍。由表2可以看出，雖然飼糧分別添加不同水平的甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖對錦江黃牛瘤胃液pH有一定影響，但除了1.00%大豆寡糖組顯著高于對照組(P＜0.05)外，其余各組與對照組間差異均不顯著(P＞0.05)，但添加功能性寡糖組的瘤胃液pH均普遍低于對照組。

2.1.2 不同功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃液BCP濃度的影響

由表2可以看出，添加功能性寡糖的各組BCP濃度均高于對照組。在甘露寡糖添加組中，1.00%甘露寡糖組培養液中BCP濃度最高，達1.24 g/L，與對照組之間差異極顯著(P＜0.01);1.20%甘露寡糖組培養液中BCP濃度也顯著高于對照組(P＜0.05)。在果寡糖添加組中，1.20%果寡糖組培養液中BCP濃度顯著高于對照組和0.80%果寡糖組(P＜0.05)。在大豆寡糖添加組中，其結果與甘露寡糖添加組相似，1.00%大豆寡糖組培養液中BCP濃度最高，達1.26 g/L，與對照組之間差異極顯著(P＜0.01)，1.20%大豆寡糖組培養液中BCP濃度也顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.1.3 不同功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃液VFA濃度的影響

由表2可以看出，在甘露寡糖添加組中，添加甘露寡糖組的培養液中VFA濃度均顯著高于對照組培養液中VFA濃度(P＜0.05)。在果寡糖添加組中，1.20%果寡糖組的培養液中VFA濃度最高，達95.97 mmol/L，與對照組間差異極顯著(P＜0.01);0.80%果寡糖組的培養液中VFA濃度也顯著高于對照組(P＜0.05);而1.00%果寡糖組的培養液中VFA濃度雖比對照組高，但差異不顯著(P＞0.05)。在大豆寡糖添加組中，1.00%和1.20%大豆寡糖組的培養液中VFA濃度均顯著高于對照組(P＜0.05)。

表2 不同功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃發酵參數的影響Table 2 Effects of different functional oligosaccharides on rumen fermentation parameters of Jinjiang cattle

同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean significant difference(P＜0.01)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 不同水平的功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃微生物生長效率的影響

由表3可以看出，甘露寡糖和大豆寡糖對錦江黃牛瘤胃微生物氮產量和微生物生長效率的影響差異均不顯著(P＞0.05)，但有提高的趨勢;而飼糧中添加果寡糖顯著提高了錦江黃牛瘤胃微生物生長效率(P＜0.05)，并呈現線性關系。根據功能性寡糖添加水平與微生物生長效率建立二次曲線模型，當甘露寡糖添加水平為1.17%時，微生物生長效率最大，為59.72 g/kg;當大豆寡糖添加水平為1.03%時，微生物生長效率最大，為59.50 g/kg。

表3 不同功能性寡糖對錦江黃牛瘤胃微生物氮產量和微生物生長效率的影響Table 3 Effects of different functional oligosaccharides on rumen microbial nitrogenproduction and microbial growth efficiency of Jinjiang cattle

3 討論

國內外大量研究表明，功能性寡糖是一種具有多種功能的營養生理活性物質，具有促進有益菌的增殖的作用。在本試驗條件下，飼糧中添加甘露寡糖、果寡糖及大豆寡糖，錦江黃牛瘤胃液pH均在6.5～6.8的正常范圍內，這與 Roberfroid［14］和 Santoso 等［15］的報道一致;適宜的瘤胃液pH是瘤胃微生物正常活動必需的，過酸或過堿都不利于微生物發酵，甚至可能導致微生物死亡，本試驗說明功能性寡糖具有維持瘤胃內環境穩定作用。

本試驗條件下，飼糧中添加甘露寡糖、果寡糖及大豆寡糖均提高了錦江黃牛瘤胃液中BCP和VFA的濃度。這可能是由于功能性寡糖促進了錦江黃牛瘤胃微生物的生長，使微生物數量增多，而大量的微生物降解有機物產生更多的氨態氮(NH3－N)、VFA 和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，同時微生物利用這部分氮源和碳源物質合成更多的BCP。王新峰等［16］研究發現，異麥芽寡糖和果寡糖能改變斷奶羔羊瘤胃菌群結構，果寡糖能明顯提高瘤胃總菌、黃化瘤胃球菌及琥珀酸絲狀桿菌的數量。Fukuya等［17］報道在仔豬飼糧中添加0.25%的果寡糖，可使仔豬糞便中的雙歧桿菌和乳酸桿菌濃度均升高。Zdunczyk等［18］也報道甘露寡糖能抑制動物腸道中大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長。Franklin等［19］報道，甘露寡糖可以促進干奶期母牛腸道有益菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)的生長與繁殖，抑制或減少其致病菌(如沙門氏菌)的生長，從而提高干奶期母牛的特異性免疫反應。凌寶明等［20］的體外批次培養試驗表明，飼糧添加適量的異麥芽寡糖和果寡糖時，均可以顯著提高生長綿羊瘤胃液中VFA濃度。劉光斌等［21］的體外培養試驗報道，在綿羊飼糧中添加不同水平的大豆寡糖能增加綿羊瘤胃液總VFA和丙酸濃度，有利于瘤胃發酵的調控。Zdunczyk等［18］報道甘露寡糖能使火雞腸道中丙酸、丁酸等VFA濃度明顯增加。而 Mwenya等［22］的試驗結果卻是，飼糧添加異麥芽寡糖對綿羊瘤胃丙酸和其他的VFA濃度均不影響。Santoso等［23］研究表明，在奶牛飼糧中添加2%的異麥芽寡糖，可增加丙酸在總VFA中的摩爾比，但差異不顯著。這些研究結果與本試驗相似，說明功能性寡糖具有改善錦江黃牛瘤胃發酵功能的作用。

關于添加寡糖對瘤胃微生物生長效率影響，目前尚未見研究報道，本試驗發現，飼糧中添加甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖，提高了錦江黃牛瘤胃微生物氮產量和生長效率，其中以果寡糖的作用最為顯著，并呈現線性關系。添加甘露寡糖和大豆寡糖的瘤胃微生物生長效率隨著添加量的增加而呈增大趨勢，添加量達到一定程度后會逐漸降低，而添加果寡糖隨著添加量的增加而呈線性增大趨勢，沒有達到最大值，這可能是由于本試驗測得寡糖添加水平梯度太少而引起的試驗誤差。從瘤胃微生物生長效率來看，飼糧添加甘露寡糖和大豆寡糖最大的微生物生長效率所對應的添加水平為1.00%～1.20%。

4 結論

飼糧添加功能性寡糖能夠穩定錦江黃牛瘤胃內環境，促進瘤胃發酵功能，提高錦江黃牛瘤胃液VFA和BCP濃度，提高錦江黃牛瘤胃微生物氮產量和微生物生長效率。綜合所有的指標，得出本試驗功能性寡糖的添加水平在1.00%～1.20%之間有利于錦江黃牛瘤胃微生物的生長。

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