不同處理鳳仙花對瘤胃微生物體外產甲烷及發酵特性的影響

張志紅 黃江麗 田曉娟 黃 黃 張國華 王東升 印遇龍 丁建南*

(1.江西省科學院生物資源研究所，南昌 330029;2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，長沙 410125)

隨著全球氣候變暖形勢的日益嚴峻，人們越來越關注溫室氣體的排放問題。甲烷(CH4)作為重要的溫室氣體之一，其溫室效應是二氧化碳(CO2)的20～30倍。畜牧業對全球溫室效應的貢獻率為9% ～18%，而反芻動物排放的CH4約占其中的80%［1］。反芻動物瘤胃內生成的CH4不僅加劇了溫室效應，同時也降低了飼料利用率，造成2% ～15%飼料總能的損失［2］。因此，研究降低瘤胃CH4排放的措施和新型添加劑已成為目前研究的熱點之一。研究表明，抗生素、離子型載體等物質能有效改善瘤胃發酵，降低CH4產量［3］。但此類物質長期使用會導致微生物產生耐藥性和藥物殘留，同時影響動物產品的品質，給動物或人類健康帶來威脅。研究發現，一些植物提取物具有調節瘤胃微生物發酵，減少 CH4釋放的效果［4－6］。因此，大力發掘植物提取物亦成為瘤胃CH4減排研究的熱點［7－8］。鳳仙花(Impatiens balsamina L.)是鳳仙花科鳳仙花屬植物，為一年生草本植物，主要分布于熱帶地區及亞熱帶地區，在中國主要產于西南地區［9］。本課題組在篩選降CH4藥用植物時發現，與青蒿、蒲公英等植物比較，鳳仙花具有顯著的降CH4效果［10］。目前國內外很少有關于鳳仙花降低瘤胃CH4生成的報道，本試驗采用體外厭氧培養技術，旨在通過研究不同處理鳳仙花對瘤胃微生物CH4產生和發酵特性的影響，并通過對 CH4、氨態氮(NH3－N)以及微生物蛋白質(MCP)等特征指標的分析，初步評價鳳仙花能否作為反芻動物降CH4植物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料與人工飼料

鳳仙花為江西省科學院生物資源研究所植物遺傳育種研究室栽培，開花后期整株采收，全株風干后粉碎過1 mm篩成為固體粉劑。固體粉劑在50℃下分別在70%乙醇和蒸餾水中浸泡48 h，料液比為1∶4，浸泡之后用超聲波提取，超聲波頻率為20 000 Hz，提取溫度為50℃。通過抽濾得到粗提液，在60℃左右將粗提液濃縮到總體積的1/5，即為鳳仙花水或乙醇浸提液。人工飼料選用稻草、玉米和黃豆，粉碎過1 mm篩備用。

1.1.2 瘤胃液

瘤胃液取自裝有永久性瘤胃瘺管的黃牛，試驗動物每天飼喂2次，飼喂時間為07:00和17:00，自由飲水。晨飼2 h后采集瘤胃瘺管中新鮮瘤胃液，迅速裝入充有氮氣的自封袋中，并用39℃保溫瓶帶回實驗室。將采集的瘤胃液用4層脫脂紗布在大燒杯中過濾，過濾時在厭氧袋中操作，減少微生物與空氣接觸機會。量取所需體積的瘤胃液迅速加入到準備好的人工唾液中(瘤胃液與人工唾液體積比為1∶2)，制成混合人工瘤胃培養液，培養液在開始前新鮮配制。人工唾液的配制參照Menke等［11］的方法。

1.1.3 瘤胃體外培養裝置

本研究使用的瘤胃體外培養裝置是在王全軍等［12］所用培養體系的基礎上改造而成，裝置由2部分組成，即培養瓶和50 mL全玻璃注射器(浙江寧波和平注射器廠)。培養瓶中放入培養液和人工飼料后，瓶口用反口膠塞和鋁蓋密封。在膠塞和鋁蓋上插入注射器，注射器接觸的地方用密封帶密封，同時注射器外圍再用醫用膠布固定。注射器每次使用之前洗凈晾干，用凡士林涂沫注射器，減少注射器內腔和塞之間摩擦。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗設10個處理，即對照(無任何添加劑，CK);3個水平的鳳仙花水浸提液，添加量分別是培養液裝量的0.5%、1.0%和2.5%(W1、W2和W3);3個水平的鳳仙花乙醇浸提液，添加量分別是培養液裝量的0.5%、1.0%和2.5%(E1、E2和E3);3個水平的鳳仙花固體粉劑，添加量分別是培養液裝量的0.5%、1.0%和2.5%(S1、S2和S3)。每個處理設7個平行，每個培養瓶為1個平行，試驗連續重復3個批次。

1.2.2 體外培養試驗操作

分別稱取稻草粉、玉米粉和黃豆粉0.90、0.45和0.15 g，組成體外培養所用人工飼料。將人工飼料送入250 mL培養瓶內，加入不同處理鳳仙花制劑。在厭氧操作袋中打開培養瓶，分別向每個瓶中加入人工瘤胃培養液200 mL，與人工飼料混合均勻。迅速蓋上膠塞和鋁蓋，用注射針頭導入氮氣，驅除瓶中空氣，確保培養瓶內為厭氧環境，插上注射器(標注1 mL刻度)。將培養瓶放入(39.0±0.5)℃恒溫培養箱中發酵培養24 h。12、18和24 h記錄注射器讀數，放空注射器再插回培養瓶。各個處理的注射器讀數與校正對照(只有培養液沒有飼料底物)比較后，轉換成產氣量。公式為:產氣量=Vt－Vi，其中Vt為各處理發酵t小時的注射器讀數，Vi為校正對照發酵t小時的注射器讀數。發酵至終點后迅速測定瓶中CH4和CO2含量，收集各處理發酵液，測定pH、NH3－N和MCP含量。

1.2.3 測定方法

CO2和 CH4含量的測定:CO2含量用 GASBOARD沼氣分析儀(武漢四方光電科技有限公司)測定;CH4含量用島津氣相色譜儀器測定:采用 HP－INNOWAX(19091N －133)毛細管柱，測定條件為柱溫80℃、氣化室溫度100℃、檢測室溫度120℃，載氣使用高純氮氣。用10 μL微量注射器分別抽取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL CH4標準氣，根據CH4含量和其峰面積關系，確定CH4標準曲線，具體條件參照胡偉蓮等［13］的方法。

發酵液參數測定:發酵液pH用梅特勒－托利多酸度計直接測定;NH3－N含量測定采用水楊酸鈉－次氯酸鈉比色法，具體過程參照馮宗慈等［14］的方法;MCP含量測定參照 Makkar等［15］分步離心法進行樣品的預處理，采用考馬斯亮藍(G250)比色法進行測定。

1.3 統計分析

數據采用Excel 2003軟件進行記錄整理，統計分析采用SAS V8軟件的Turkey法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，試驗結果用平均值±標準誤表示。

2 結果

2.1 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵產氣量的影響

從表1看出，不同處理的鳳仙花體外培養瘤胃產氣量不同。比較12 h產氣量，CK產氣量最低，S3比CK產氣量提高了86.7%(P＜0.05)，且顯著高于其他鳳仙花處理(P＜0.05)。18 h產氣量中，CK也是最低，S1、S2和S3均顯著高于其他處理(P＜0.05)。24 h產氣量中，CK依然最低，S1、S2、S3和 E3顯著高于其他處理(P ＜0.05)。比較24 h累積產氣量，固體粉劑處理均顯著高于CK(P＜0.05)，平均為96.02 mL，比 CK提高了56.8%;E2和E3顯著高于 CK(P＜0.05)，乙醇浸提液處理累積產氣量平均為76.37 mL，比CK提高了24.7%;水浸提液僅W3累積產氣量顯著高于CK(P＜0.05)，3個處理平均為69.90 mL，比CK提高了14.1%。鳳仙花不同處理中，添加量和產氣量之間也表現出一定關系，添加量低，產氣量低，添加量高時，產氣量也相應提高。

表1 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵產氣量的影響Table 1 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on gas production in vitro rumen fermentation

同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，while with the same letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵CH4、CO2含量和pH的影響

不同處理鳳仙花對體外培養CH4、CO2含量以及pH的影響見表2，CK CH4含量最高，而S3為0，完全抑制了CH4生成;S1、S2和E3 CH4含量小于1%，W1和W2與CK比較，沒有顯著差異(P＞0.05)。比較鳳仙花不同添加量對CH4含量的影響可以發現，隨著添加量增加，CH4含量越來越低。CO2含量變化與CH4相反，在所有處理中，CK最低，S3最高，S3比CK提高了88.5%(P＜0.05)。鳳仙花3種添加方式中，固體粉劑對CO2含量提高最明顯，平均比CK提高了64.9%，其次是乙醇浸提液，平均比CK提高了36.1%，水浸提液效果較差，平均比CK提高了11.2%。隨著添加量的增加，CO2含量提高十分明顯。pH變化趨勢與CH4相同，CK最高，S3最低，并且差異顯著(P＜0.05)。鳳仙花不同處理中，固體粉劑降低pH最明顯。

2.3 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵NH3－N含量的影響

NH3－N是瘤胃微生物發酵一個重要參數，反映了瘤胃代謝狀態。不同處理鳳仙花對NH3－N含量的影響見表3，CK最高，S3最低，差異顯著(P＜0.05)。NH3－N含量整體變化趨勢與CH4相似，添加量相同時，鳳仙花固體粉劑降低最明顯。隨著添加量的增加，NH3－N含量降低越明顯，S1、S2和S3分別比CK降低了41.1%(P＜0.05)、52.2%(P ＜0.05)和 55.4%(P ＜0.05)，E1、E2和E3分別比CK降低了12.8%(P＞0.05)、29.7%(P ＜0.05)和 48.2%(P ＜0.05)，W1、W2和W3分別比CK降低了5.9%(P＞0.05)、6.2%(P＞0.05)和42.9%(P＜0.05)。

表2 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵CH4、CO2含量和pH的影響(24 h)Table 2 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on CH4，CO2contents and pH in vitro rumen fermentation(24 h)

表3 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵NH3－N和MCP含量的影響(24 h)Table 3 Effects of different preparations of Impatiens balsamina on NH3－N and MCP contents in vitro rumen fermentation(24 h)

2.4 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵MCP的影響

從表3看出，體外發酵液中CK的MCP含量最低，鳳仙花固體粉劑處理的MCP含量高，S1、S2和S3分別比CK提高了84.9%(P＜0.05)、139.7%(P＜0.05)和199.7%(P＜0.05);E1、E2和E3分別比CK提高了60.0%(P＜0.05)、77.4%(P＜0.05)和94.8%(P＜0.05);水浸提液對MCP提高效果比乙醇浸提液差，W1、W2和W3分別比CK提高了4.5%(P＞0.05)、30.5%(P＞0.05)和43.1%(P＜0.05)。在鳳仙花相同處理中，隨著添加量的增加，MCP含量逐漸提高。

3 討論

3.1 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵產氣量以及CH4和CO2含量的影響

研究結果表明，產氣量越高，瘤胃內的發酵活動越劇烈，對反芻動物的促進作用越明顯［16］。從試驗結果看，鳳仙花不同處理對體外瘤胃發酵有一定影響，與CK比較，從開始到培養結束，鳳仙花均可以刺激瘤胃微生物發酵代謝活動，提高瘤胃產氣量，添加量高時效果越明顯。鳳仙花對CH4和CO2含量的影響相反，CH4含量均比CK低，這可能是與CH4生成受到抑制時，引起CO2和氫氣(H2)等的累積有關［17］，其中原因以及瘤胃中產CH4微生物的變化特征還有待進一步研究。研究發現，莫能菌素具有明顯降低CH4生成的效果，但是在飼糧中莫能菌素含量較高時抑制CO2產生，影響瘤胃微生物代謝活動，初步分析兩者降甲烷作用方式可能不同。

3.2 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵pH的影響

瘤胃液pH是反映瘤胃內發酵狀況的一項綜合指標。瘤胃微生物以瘤胃為其直接的生長環境，pH過高或過低對瘤胃微生物的正常生長、發育及發酵均有不利的影響。通常認為正常的瘤胃pH變化范圍為6～7，當pH低于6時，纖維分解菌和原蟲數量將減少，飼糧中纖維素和蛋白質的降解率就會降低［18］。在本試驗中體外發酵24 h各處理pH均大于6，pH的變化范圍未超出瘤胃微生物的最適生長范圍。隨著不同處理鳳仙花添加量的增加，pH有降低的趨勢，但對瘤胃發酵沒有產生不利影響。添加鳳仙花引起pH降低，分析原因可能是鳳仙花改變了瘤胃微生物發酵方式，引起揮發性脂肪酸(VFA)等物質增加，又由于采用不連續體外培養方式，造成代謝產物不能及時排出而累積［19］。

3.3 不同處理鳳仙花對體外瘤胃發酵NH3－N和MCP含量的影響

瘤胃液中NH3－N是瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質和內源含氮物質降解的重要產物，同時也是瘤胃微生物合成MCP的原料，它反映了瘤胃內微生物氮的供應狀況［20］。MCP代謝是瘤胃微生物區系營養代謝的一個重要組成部分，是反芻動物最主要的氮源供應者，它可以滿足動物營養需要量的40%～80%。由于體外培養沒有瘤胃壁對NH3－N 的吸收、分泌等的影響，所以 NH3－N 的含量主要取決于2個方面:一方面是瘤胃微生物降解飼糧中的含氮化合物為NH3－N的能力，另一方面是瘤胃微生物利用NH3－N合成MCP的能力。本試驗中，體外培養24 h后，添加鳳仙花各處理的NH3－N含量不同程度低于 CK，降低了5.8% ～55.4%;MCP含量相反，鳳仙花處理均比CK高，比CK增加了4.5%～199.7%。結果表明，鳳仙花處理刺激了瘤胃微生物代謝活動，促進NH3－N向MCP轉化，加快了MCP的合成，這個結果與前人報道茶皂素等植物提取物具有減少瘤胃NH3－N含量、促進MCP合成［21］的結論一致。

3.4 鳳仙花不同處理方式瘤胃發酵效果比較

比較鳳仙花水和乙醇浸提液以及固體粉劑體外瘤胃發酵效果，從CH4、CO2和MCP含量等數據看，添加量相同時，固體粉劑的效果最好，水浸提液效果最差。直接添加固體粉劑，其中的糖、蛋白質等營養物質也可被微生物利用，促進瘤胃發酵，因此效果更好。鳳仙花乙醇浸提液效果比水浸提液好，這表明降CH4有效成分極性較弱，更容易被有機溶劑浸提。因此，在以后研究中可以選用不同有機溶劑浸提鳳仙花，比較體外培養降甲烷效果，并分析有效成分的性質和結構。

4 結論

①不同處理鳳仙花均能有效降低CH4產生，促進NH3－N向MCP轉化，添加量高(2.5%)時效果更明顯。

②比較水浸提液、乙醇浸提液和固體粉劑體外培養效果，固體粉劑最好。

③鳳仙花有望成為新的降CH4植物。

［1］ GILL M，SMITH P，WILKINSON J M.Mitigating climate change:the role of domestic livestock［J］.Animal，2010，4(3):323 －333.

［2］ JOHNSON K A，JOHNSON D E.Methane emission from cattle［J］.Journal of Animal Science，1995，73:2483－2492.

［3］ YANG C M，RUSSELL J B.The effect of monensin supplementation on ruminal ammonia accumulation in vivo and the numbers of amino acid－fermenting bacteria［J］.Journal of Animal Science，1993，71(12):3470－3476.

［4］ WALLACE R J.Antimicrobial properties of plant secondary metabolites［J］.Proceedings of the Nutrition Society，2004，63:621 －629.

［5］ 陸燕，林波，王恬，等.大蒜油對體外瘤胃發酵、甲烷生成和微生物區系的影響［J］.動物營養學報，2010，22(2):386 －392.

［6］ BUSQUET M，CALSAMIGLIA S，FERRET A，et al.Plant extracts affectin vitrorumen microbial fermentation［J］.Journal of Dairy Science，2006，89:761 －771.

［7］ AMLAN K P，JYOTIANA S.A new perspective on the use of plant secondary metabolites to inhibit methanogenesis in the rumen［J］.Phytochemistry，2010，71:1198－1222.

［8］ PATRA A.Chemical constituents of Impatiens balsamina L.［J］.Chemical Society，1988，19(6):367－368.

［9］ 胡喜蘭，朱慧，劉存瑞，等.鳳仙花的化學成分研究［J］.中成藥，2003，25(10):833.

［10］ 張志紅，黃江麗，田曉娟，等.幾種植物提取物對瘤胃體外培養物甲烷生成的影響［J］.江西科學，2011，29(1):43 －45.

［11］ MENKE K H，STEINGASS H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid［J］.Animal Research and Development，1988，28:7 － 55.

［12］ 王全軍，毛勝勇，張紅霞，等.半胱胺對山羊瘤胃微生物體外發酵的影響［J］.華中農業大學學報，2002，21(6):535 －539.

［13］ 胡偉蓮，王佳堃，呂建敏.瘤胃體外發酵產物中的甲烷和有機酸含量的快速測定［J］.浙江大學學報:農業與生命科學版，2006，32(2):217－221.

［14］ 馮宗慈，高民.通過比色測定瘤胃液氨氮含量方法的改進［J］.內蒙古畜牧科學，1993(4):40.

［15］ MAKKAR H P S，SHAVMA O P，DAWRA R K，et al.Simple determination of microbial protein in rumen liquor［J］.Journal of Dairy Science，1982，65:2170 －2173.

［16］ MENKE K H，RAAB L，SALEWSKI A，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro［J］.The Journal of Agricultural Science，1979，93:217－222.

［17］ LóPEZ S，VALDéS C，NEWBOLD C J，et al.Influence of sodium fumarate addition on rumen fermentation in vitro［J］.British Journal of Nutrition，1999，81:59－64.

［18］ BROWN M S，PONCE C H，PULIKANTI R，et al.Adaptation of beef cattle to high－concentrate diets:performance and ruminal metabolism［J］.Journal of Animal Science，2006，84:25 －33.

［19］ 陳俊材，王威，王之盛.利用體外法研究納米氧化鋅的添加對瘤胃發酵的影響［J］.動物營養學報，2011，23(8):1415 －1421.

［20］ 王聰，劉強，董群，等.日糧補充蘋果酸對牛瘤胃發酵和養分消化代謝的影響［J］.草業學報，2009，18(3):224－231.

［21］ 葉均安.茶皂索對湖羊生產性能的影響［J］.飼料研究，2001，6:33.