啤酒糟部分替代豆粕對水牛體外瘤胃發酵特性和甲烷生成的影響

黃雅莉 鄒彩霞 黃連瑩 梁賢威 夏中生* 韋升菊 梁 辛

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530005;2.中國農業科學院廣西水牛研究所，南寧 530001)

啤酒糟是一種以大麥為原料，經發酵提取籽實中部分可溶性碳水化合物生產啤酒后剩下的副產品，其蛋白質含量高，過瘤胃蛋白質含量高，礦物質、維生素含量豐富。此外，其適口性好，價格低廉，貨源較充足，是奶牛的理想飼料。近年來，隨著畜牧業的快速發展，飼料資源特別是蛋白質飼料日趨緊缺，開發利用飼料資源，降低飼養成本，已成為世界各國共同關心的問題。用富含蛋白質的啤酒糟作為奶牛飼糧蛋白質源具有以下的優點:1)節約飼料;2)可以代替部分精飼料，以減少飼料成本;3)減少熱應激。

目前已有許多學者在啤酒糟飼喂牛方面做了一些研究報道。王星凌［1］在荷斯坦奶牛飼糧中添加棗、大豆皮和鮮啤酒糟，結果表明這種低成本的飼糧有助于提高產奶量、乳成分和經濟效益。薛志成［2］利用干啤酒糟代替飼糧中20%的精飼料飼喂泌乳牛，結果表明飼喂干啤酒糟組產奶量比對照組減少1.6%，差異不顯著，但是每頭牛每天多盈利0.64元，經濟效益十分顯著。孫桂芬［3］用啤酒糟飼喂泌乳中后期奶牛，結果表明飼糧中添加啤酒糟不僅可以減緩泌乳中后期奶牛產奶量的下降幅度，而且每頭每天飼喂添加啤酒糟飼糧的奶牛產出凈利潤比不添加啤酒糟的奶牛增加0.424元。王海濱［4］報道啤酒糟飼喂奶牛，當精飼料喂量為7.20 kg、鮮啤酒糟喂量達到10.30 kg時，奶牛平均泌乳單產最高(14.45 kg)，毛利潤為13.68元/(頭·d);當精飼料喂量為6.10 kg、鮮啤酒糟喂量達到11.70 kg時，毛利潤為15.02元/(頭·d)，該研究表明，奶牛飼糧中添加10 kg左右的鮮啤酒糟可提高產奶量，并降低飼養成本，對泌乳中后期奶牛飼喂效果尤為顯著，對牛的健康無不良影響。

啤酒糟在作為蛋白質飼料部分替代精飼料飼喂動物的研究報道比較少。因而，更深層次的開展這方面的應用研究工作十分重要。本試驗利用啤酒糟蛋白質含量高的這一特性，通過采用體外產氣的方法，在體外條件下研究飼糧中啤酒糟以不同水平替代豆粕對水牛瘤胃發酵功能及甲烷產量的影響，確定啤酒糟替代豆粕的可行性及最佳的替代水平，以緩解我國日益緊缺的蛋白質飼料資源，也為今后開展啤酒糟在反芻動物營養研究應用中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用豆粕、玉米、啤酒糟、玉米秸稈、象草和美國苜蓿均采自廣西水牛研究所，經65℃烘干制成風干樣后粉碎過40目篩。經過分析測定，本試驗采用的啤酒糟干物質含量為25.82%，粗蛋白質含量為30.41%，中性洗滌纖維含量為62.60%，酸性洗滌纖維含量為13.55%，粗纖維含量為9.07%，鈣含量為0.31%，磷含量為0.53%。

1.2 試驗設計

設計發酵底物的精粗比為4∶6(風干基礎)，其中玉米25%、豆粕15%、玉米秸稈30%、象草30%。啤酒糟以0、25%、50%、75%和100%(風干基礎)替代發酵底物中的豆粕。體外產氣試驗發酵底物見表1。另設1個空白對照組和1個標準干草美國苜蓿組，標準干草美國苜蓿組用于消除試驗誤差，在所有時間點的產氣試驗結束后，對所測的結果都采用標準干草的測定值進行校正，以消除試驗誤差。此外，如果試驗標準干草的實測值與標準值差異很大時，要重新進行發酵培養。

1.3 試驗方法

1.3.1 體外培養體系

本試驗采用Mauricio等［5］的壓力讀取式體外產氣系統(reading pressure system)進行體外瘤胃發酵，厭氧人工瘤胃緩沖液的配制參照Theodorou等［6］的方法。體外培養裝置主體為恒溫水浴搖床。培養底物為750 mg(干物質基礎)，培養時間為72 h。1.3.2 瘤胃液供體動物及其飼養

表1 體外發酵底物(風干基礎)Table 1 Substrates for in vitro fermentation(air－dry basis) %

選擇3頭體重為(400±5)kg安裝有永久性瘤胃瘺管的水牛作為瘤胃液的供體動物。飼糧參照廣西水牛研究所的日常飼養配方配制，精粗比為3∶7(風干基礎)，粗飼料為象草。飼糧營養水平為粗蛋白質13.72%、產奶凈能6.44 MJ/kg、鈣0.72%、磷0.48%。瘺管牛采用栓系式飼養，每日于08:00和17:00各飼喂1次，自由飲水，常規光照、驅蟲及管理。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 產氣量(gas production，GP)的測定

產氣量測定參考Theodorou等［6］的方法，分別于培養2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 時用壓力傳感器讀取產氣瓶內壓力，并放氣。根據以下公式計算出產氣量:

式中:GPt為樣品在t時刻的產氣量(mL/g)，Pt為樣品在t時刻讀取的壓力(mPa)，Pt空白為空白對照在t時刻的產氣壓力(mPa)，V0為瓶子體積(mL)，101.3為標準大氣壓(mPa)，W為樣品干物質質量(mg)。

產氣過程的累積產氣量為各時間段產氣量之和。

根據以下公式計算出各部分產氣量:

GP=a+b(1－e－ct)。

式中:GP為產氣量(mL/g)，a為快速產氣部分產氣量(mL/g)，b為慢速產氣部分的產氣量(mL/g)，c為產氣速率常數(h－1)，a+b 為潛在產氣量(mL/g)，t為培養時間(h)。

1.4.2 可消化有機物含量和代謝能的測定

以200 mg(干物質基礎)底物為單位進行發酵，根據體外產氣法培養24 h后得到的產氣量計算可消化有機物，計算公式如下:

DOM=(7.65 ±0.062)GP24h+(353 ±0.59)［7］。

式中:DOM為可消化有機物(g/kg)，GP24h為24 h累積產氣量(mL/g)。代謝能計算公式如下:

DO=17.04+1.108 5GP24h;ME= －0.200 0+0.141 0DO［8］。式中:DO為有機物消化率(%)，ME為代謝能(MJ/kg)。

1.4.3 氨態氮濃度的測定

取體外發酵培養24 h后的培養液5 mL，經過3 000 × g 離心10 min，取上清液，采用 Searle［9］、馮宗慈等［10］的改進方法，用氯化銨作標準品，采用紫外可見分光光度計(PE Lambda 35型，美國)在700 nm波長條件下比色，根據光密度值和標準曲線求出氨態氮的濃度。

1.4.4 微生物蛋白質濃度的測定

取體外發酵培養24 h后的培養液8 mL，采用嘌呤法測定體外微生物蛋白質產量，經過處理后的待測液以0.5 mol/L鹽酸溶液作參比，采用紫外可見分光光度計(PE Lambda 35型，美國)在260 nm下比色，根據光密度值和標準曲線求出RNA測定值，根據以下公式計算微生物蛋白質產量:

微生物蛋白質(mg/mL)=［RNA測定值(mg/mL)×RNA含氮量(%)/

細菌氮中RNA含氮量(%)］×

稀釋倍數 ×6.25［8］。

式中，RNA含氮量為17.83%，細菌氮中RNA含氮量為10%。

1.4.5 揮發性脂肪酸濃度的測定

取體外發酵培養24 h后的上清液1 mL，加入等體積8.2%的偏磷酸，4℃ 20 000×g下離心10 min，取離心后的上清液加入內標物巴豆酸，儀器為Agilent 7890A型氣相色譜儀，色譜柱為HPINNOWAX(19091N－133)毛細管柱，規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。測定上清液中乙酸、丙酸和丁酸的濃度。

1.4.6 甲烷產量的測定

分別在培養6、12、24 h時各抽取10 μL氣體用手動式進樣法用Agilent 7890A型氣相色譜儀測定甲烷產量，色譜柱為HP－INNOWAX(19091N－133)毛細管柱，規格為30 m ×0.25 mm ×0.25 μm。

1.5 數據統計處理

試驗數據用 Excel軟件進行處理，然后用SPSS 16.0軟件進行方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，試驗數據用平均值±標準誤表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷的標準。

2 結果

2.1 72 h內產氣量、72 h累積產氣量、可消化有機物含量和代謝能

由圖1和表2可知，72 h累積產氣量、可消化有機物含量和代謝能這3個指標隨著啤酒糟替代比例的增加而呈降低趨勢。72 h累積產氣量0組與25%組、50%組之間差異不顯著(P＞0.05)，這3個組與75%組差異顯著(P＜0.05)，與100%組差異極顯著(P＜0.01)。可消化有機物含量和代謝能各個組之間差異顯著(P＜0.05)。

圖1 啤酒糟替代不同比例豆粕對72 h內產氣量的影響Fig.1 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on GP in 72 h

表2 啤酒糟替代不同比例豆粕對72 h累積產氣量、可消化有機物含量和代謝能的影響Table 2 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on accumulation of GP in 72 h，digestible organic matter content and metabolisable energy

同行數據肩標相鄰小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，相間小寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values with adjacent letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with alternate letter superscripts mean significant difference(P＜0.01)，while with the same letter superscript mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

由表3可知，快速產氣部分產氣量、慢速產氣部分產氣量、潛在產氣量和產氣速率常數都隨著啤酒糟替代比例的增加而呈降低趨勢，變化不顯著(P＞0.05)。

表3 啤酒糟替代不同比例豆粕對各組分產氣量的影響Table 3 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on GP of constituents

2.2 氨態氮和微生物蛋白質濃度

由表4可知，氨態氮、微生物蛋白質濃度隨著啤酒糟替代比例的增加而總體呈降低趨勢。氨態氮濃度25%組最高，極顯著高于50%組和75%組(P＜0.01)，這2組之間差異不顯著(P＞0.05)，0組與25%組差異不顯著(P＞0.05)。微生物蛋白質濃度0組最高，次之依次為50%組、25%組、100%組和75%組，0組與25%組、50%組差異不顯著(P＞0.05)，與75%組差異極顯著(P＜0.01)，與100%組差異顯著(P＜0.05)。

2.3 揮發性脂肪酸濃度

由表5可知，乙酸濃度25%組最高，次之依次為50%組、0組、100%組、75%組，25%組顯著高于0組、100%組和75%組(P＜0.05)。丙酸、總揮發性脂肪酸濃度均以25%組最高，且25%組均顯著高于75%組、100%組(P＜0.05)。丁酸濃度25%組最高，次之依次為75%組、0組、50%組、100%組，25%組顯著高于100%組(P＜0.05)。乙酸/丙酸25%組最高，顯著高于0組和75%組(P＜0.05)。

由表6可知，6 h 75%組甲烷產量最高，顯著高于0組、25%組、50%組(P＜0.05)，這3組之間差異不顯著(P＞0.05)。12和24 h甲烷產量隨著啤酒糟替代比例的增加而呈增加趨勢。12 h甲烷產量0組與25%組、50%組差異不顯著(P＞0.05)，它們均顯著低于其他2組(P＜0.05)。24 h甲烷產量0組與25%組差異不顯著(P＞0.05)，它們顯著低于50%組(P＜0.05)并極顯著低于75%組、100%組(P＜0.01)。

2.4 甲烷產量

表4 啤酒糟替代不同比例豆粕對氨態氮、微生物蛋白質濃度的影響Table 4 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on concentrations of ammonia nitrogen and microbial protein

表5 啤酒糟替代不同比例豆粕對揮發性脂肪酸濃度的影響Table 5 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains atdifferent ratios on concentrations of volatile fatty acids

表6 啤酒糟替代不同比例豆粕對甲烷產量的影響Table 6 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on methane production mmol

3 討論

3.1 啤酒糟替代不同比例豆粕對產氣量、可消化有機物含量、代謝能的影響

產氣量作為綜合反映飼料的可發酵程度指標，不僅能表現瘤胃中微生物活動的總體趨勢，還是能反映飼料蛋白質營養價值的綜合指標［11］。產氣量的多少反映了飼草的可消化性的大小，它與飼料中有機物的發酵程度成正相關，飼料的可發酵性越強，瘤胃中微生物的活性越高，產氣量就越大，反之則越少。易賢武［12］進行了西蘭花莖葉粉不同比例替代豆粕的體外瘤胃發酵研究，結果表明隨著西蘭花莖葉粉替代水平的增加，0～72 h累積產氣量逐漸下降。本試驗72 h累積產氣量各組之間依次降低，與上述研究結果相一致。可消化有機物含量和代謝能是根據24 h產氣量計算出來的，它們與24 h產氣量成正比關系，所以這2個指標也是隨替代比例增加依次降低。產氣量中慢速產氣部分產氣量、潛在產氣量及產氣速率常數0組與50%組相差均不大。

3.2 啤酒糟替代不同比例豆粕對氨態氮、微生物蛋白質濃度的影響

氨態氮是瘤胃內飼料肽、氨基酸、蛋白質、尿素、氨化物及其他非蛋白氮分解的終產物，同時也是瘤胃微生物合成菌體蛋白質的主要原料［13］。瘤胃中氨態氮的濃度過高或過低都不利于微生物的生長繁殖，因此保持瘤胃液中最適氨態氮濃度是保證微生物蛋白質合成的首要條件。Lees等［14］發現奶牛補飼蛋白質飼料能提高氨態氮的濃度。夏楠等［15］研究發現采用豆粕、棉粕、菜籽粕的飼糧山羊瘤胃液氨態氮濃度顯著高于采用玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)的飼糧，這與前三者的蛋白質含量比DDGS高有關。王夢芝等［16］研究羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和魚粉對瘤胃微生物體外發酵的影響，結果表明氨態氮濃度豆粕組最高，羽毛粉組最低。從本試驗結果可以看出，隨著啤酒糟替代豆粕比例的增加，氨態氮濃度顯著下降，這與啤酒糟的蛋白質含量低于豆粕有關。本試驗與上述研究結果相一致。

微生物蛋白質是反芻動物最主要的氮源供應者，能提供動物蛋白質需要的40% ～80%。微生物蛋白質濃度反映了微生物利用氨態氮的能力;微生物蛋白質濃度也間接地反映了培養體系中微生物種群的數量。從本試驗結果可以看出，0組微生物蛋白質與25%組、50%組差異不顯著，但與75%組差異極顯著、與100%組差異顯著。本試驗結果表明，啤酒糟作為水牛蛋白質飼料在0～50%替代豆粕對體外發酵特性無顯著影響。

3.3 啤酒糟替代不同比例豆粕對揮發性脂肪酸濃度的影響

瘤胃碳水化合物發酵的主要產物是乙酸、丙酸和丁酸等揮發性脂肪酸。它們是反芻動物主要的能量來源及合成乳脂和體脂的原料。揮發性脂肪酸的產量及其比例可顯著影響反芻動物對營養物質的吸收、利用和生產性能的發揮。易賢武［12］研究西蘭花莖葉粉不同比例替代豆粕，結果表明隨著西蘭花莖葉粉替代豆粕的比例增加，總揮發性脂肪酸濃度下降，但對乙酸、丙酸和丁酸濃度都無顯著影響。本試驗研究結果與上述研究結果相一致。

3.4 啤酒糟替代不同比例豆粕對甲烷產量的影響

瘤胃內甲烷是有機物發酵的必然產物之一。瘤胃內甲烷的產生既是能量的損失，同時也是造成溫室效應的主要原因之一。飼糧中粗飼料比例越高，甲烷產量越高［17］。Lovett等［18］認為，提高奶牛飼糧精飼料比例能降低甲烷的生成量。本試驗在6和12 h 0組甲烷產量與25%組、50%組差異不顯著。12和24 h甲烷產量隨著替代比例的增加而呈增加趨勢。本試驗結果可以看出啤酒糟作為粗飼料，它替代豆粕的比例越高，產生的甲烷量也越高，飼糧中粗飼料比例越高，甲烷產量越高的研究結果一致。

4 結論

①啤酒糟0～50%替代豆粕對體外瘤胃發酵及甲烷產量無顯著性影響。

②啤酒糟50%～100%替代豆粕降低了產氣量、可消化有機物含量、代謝能、微生物蛋白質濃度、揮發性脂肪酸濃度，并顯著提高甲烷產量。

③啤酒糟作為水牛蛋白質飼料0～50%替代豆粕為宜。

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