蘇氨酸對體外培養感染偽狂犬病毒豬空腸上皮細胞免疫相關基因表達的影響

韓國全 余 冰，2 陳代文，2* 相振田 陳渝 陳洪 毛倩

(1.四川農業大學動物營養研究所，雅安 625014;2.四川農業大學動物抗病營養教育部重點實驗室，雅安 625014)

蘇氨酸(threonine，Thr)由學者 Rose 等［1－3］在20世紀30年代年通過關于氨基酸組成的動物飼養試驗中預測并證實的，而且從纖維蛋白質水解混合物中首次獲得純分離物，因其空間結構與蘇糖相似而命名。蘇氨酸是動物飼糧中的第二或第三限制性氨基酸，具有突出的生理功效，對其研究一直是動物營養研究領域中的熱點之一。良好的免疫功能是動物獲得最佳生產性能的基礎，而良好的營養水平亦是動物獲得最佳免疫水平的基礎。蘇氨酸在氨基酸營養中具有關鍵作用，同時對免疫的影響也較大，近年來其在分子營養與免疫領域引起了相關學者的極大關注。Fuller等［4］與Stoll等［5］報道健康的腸道可吸收截留來自飼糧中60% ～80%蘇氨酸，與其他腸道蛋白質相比，腸道黏膜蛋白中尤其富含蘇氨酸(占其氨基酸組成的30%)。Wang等［6］在研究人工感染大腸桿菌的斷奶仔豬時觀察到，增加飼糧中的蘇氨酸含量，抗體產量增加，血清中免疫球蛋白G(IgG)濃度以及回腸黏膜中IgG和免疫球蛋白(IgA)的濃度均有所提高，同時降低了回腸黏膜中白介素6(IL－6)的含量。Faure等［7］通過研究氨基酸合成代謝反應對蘇氨酸的利用率發現，小鼠感染敗血癥時對蘇氨酸需要的增幅高于其他必需氨基酸。Remond等［8］利用迷你豬動物模型，考察急性回腸炎應激下胃腸道蘇氨酸攝入與黏液素的合成特點，結果顯示小腸蘇氨酸水平對黏膜蛋白和黏液素合成影響較大，腸內補充蘇氨酸顯著減輕臨床腸道炎癥。疫病應激下機體快速合成大量的急性期蛋白和免疫球蛋白，這些蛋白的氨基酸組成不同于機體組織，蘇氨酸的比例要高于機體組織，因此，它的需要量大幅增加。

IPEC－J2細胞是分離自未吮乳的新生仔豬空腸上皮細胞，屬于非轉化性最初的連續培養小腸細胞系，具有典型的豬小腸上皮細胞特性［9］，因此，IPEC－J2細胞可以作為極好的小腸體外模型用以研究營養物質與小腸上皮細胞的作用機制。豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科甲皰疹病毒亞科，主要特征是宿主范圍廣，有高度的細胞致病性且復制周期短。研究證實多數雜交瘤細胞系和原代細胞都適合PRV的培養，實驗室多用PK－15或SK－6細胞，PRV誘導的致細胞病變(CPE)一般出現在攻毒后的24～72 h。PRV感染致病時，所有被波及的組織均呈灶性壞死。Narita等［10］研究發現PRV感染在小腸發生黏膜上皮灶性壞死病變時，可能波及至黏膜肌層和外膜，核內包涵體見于受損的腸上皮細胞，胞核發生明顯的固縮和核碎裂。作者將PRV接種IPECJ2細胞，72 h觀察到細胞呈典型“拉網狀”和細胞脫落的CPE，病毒檢測陽性，證實PRV能夠成功感染IPEC－J2細胞。本研究以 IPEC－J2細胞為小腸細胞體外模型，考察補充不同水平蘇氨酸對感染PRV的細胞免疫相關基因表達的影響，旨在從分子水平深入理解蘇氨酸對小腸上皮細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗毒株與細胞株

PRV野毒株Fa株:四川農業大學動物醫學院預防獸醫學實驗室繁殖凍存;IPEC－J2細胞:四川農業大學動物營養研究所豬營養實驗室繁殖凍存。

1.1.2 主要試劑

蘇氨酸以L－蘇氨酸形式添加，為美國Sigma公司產品;總RNA提取試劑(TRIzolReagent)為美國Invitrogen公司產品;反轉錄試劑(iScriptTMcDNA Synthesis Kits)、定量 PCR試劑(SoFastTMEvaGreenSupermix)均為美國 Bio－Rad公司產品;細胞基礎培養基［DMEM/F－12(1∶1)］干粉、胎牛血清(FCS)、細胞消化液(0.25%trypsin－EDTA)均為美國HyClone公司產品;相對分子質量標準DL2000為大連寶生物公司產品;核酸染料(GoldViewTM)為北京賽百勝基因技術有限公司產品;其余試劑為國產分析純。

1.1.3 主要儀器

電熱水浴二氧化碳細胞培養箱(Thermo Scientific Revco UltimaⅡ)為美國Thermo公司產品;超純水儀(Milli－Q)為美國Millipore公司產品;倒置生物顯微鏡(TS100－F)為日本Nikon公司產品;實時熒光定量PCR儀(CFX096)、梯度PCR儀(MyCycler Thermal Cycler)、凝膠成像系統(GEL DOC2000)、穩壓電泳儀(PowerPac Universal)均為美國Bio－Rad公司產品;高速冷凍離心機(Allegra 64R)為美國Beckman Coulter公司產品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

本試驗選用IPEC－J2細胞模型，分為4組，對照組未經偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV感染、蘇氨酸濃度為53.45 mg/L，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為試驗組，經PRV感染，蘇氨酸濃度分別為53.45、106.90、160.35 mg/L。每組3個重復，每個重復4孔。

1.2.2 試劑配制

基礎培養基:取12.1 g(1袋)細胞基礎培養基干粉溶于950 mL超純水中，超純水沖洗包裝袋3～5次，磁力攪拌溶解，加入1.2 g碳酸氫鈉和適量4－羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液調整pH至7.0左右，定容至1 000 mL，不銹鋼濾器(孔徑0.22 μm)過濾除菌，分裝并抽樣無菌檢驗，置于4℃避光保存。

完全培養基:無菌操作將胎牛血清按照10%(體積比)加入到基礎培養基，置于4℃避光保存。

蘇氨酸儲備液(53.45 g/L):稱取1.069 0 g L－蘇氨酸，室溫(20℃)下溶于20 mL基礎培養基中，0.22 μm 過濾除菌，以 1.5 mL/管分裝于2.0 mL無菌離心管，－20℃避光保存。

補充蘇氨酸的培養基:將蘇氨酸儲存液恢復至室溫，混勻，按合適比例加入到基礎培養基中，分別配制蘇氨酸濃度為 53.45、106.90、160.35 mg/L的培養基，置于4℃避光保存。

1.2.3 細胞常規培養

IPEC－J2細胞采用完全培養基培養，2～3 d更換1次培養基，待80%～100%融合時用細胞消化液消化傳代，培養瓶置于37℃、5%CO2電熱水浴二氧化碳細胞培養箱培養，每天定時觀察細胞生長情況。

1.2.4 病毒增殖與滴度測定

采用IPEC－J2細胞增殖PRV，離心過濾收集病毒液。同時使用IPEC－J2細胞測定PRV的病毒滴度，采用 Reed－Muench兩氏法［12］計算病毒組織半數感染量(TCID50)。

1.2.5 PRV感染與蘇氨酸處理

將消化后的IPEC－J2細胞采用完全培養基稀釋懸液至 5.0×105個/mL，以 200 μL/孔接種于12孔細胞培養盤，共接種4盤。置于37℃、5%CO2電熱水浴二氧化碳細胞培養箱培養，每天定時觀察細胞，24 h更換1次培養基。待75% ～85%融合時，吸除培養基，使用基礎培養基洗滌2～3次后，對照組每孔分別加入200 μL基礎培養基，試驗組則每孔分別加入200 μL PRV病毒稀釋液(1 TCID50/μL)，平均到4個盤上;置于 37℃、5%CO2中吸附1 h，每15 min勻速搖振細胞培養盤以確保充分吸附病毒;完全吸除各孔中液體，使用基礎培養基洗滌2次，每孔分別加入相應補充L－蘇氨酸的培養基800 μL，置于37℃、5%CO2孵育。IPEC－J2細胞的PRV感染、蘇氨酸補充見表1。

分別于加入處理培養基后1、6、12、24 h取相應培養盤細胞，吸除上清，每孔加入0.5 mL總RNA提取試劑，室溫裂解細胞5～10 min后轉移至無菌1.5 mL離心管中，置于－75℃凍存備用。1.2.6 細胞總RNA的制備和反轉錄

參照總RNA提取試劑說明書，提取細胞總RNA，并用脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)處理制備的細胞總RNA樣品，置于－75℃凍存備用。反轉錄參照反轉錄試劑說明書進行，cDNA產物置于－20℃凍存備用。

1.2.7 實時定量PCR

采用豬持家基因(housekeeping gene)β－肌動蛋白(β－actin)作為內參基因。登錄美國NCBI網站，從GenBank數據庫檢索并下載保存豬的白介素 1β(IL－1β)、IL－6、白介素 15(IL－15)、腫瘤壞死因子 α(TNF－α)、轉化生長因子 β1(TGF－β1)及 βactin的基因序列。綜合應用軟件Oligo 7.0與Primier 5.0自行設計實時定量PCR引物，引物序列及參數見表2。引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。實時定量PCR、產物回收及TA克隆均參照文獻［11］相關方法操作，TA克隆質粒交由上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序。

表1 IPEC－J2細胞的偽狂犬病病毒感染、蘇氨酸補充Table 1 PRV infection and Thrsupplementation of IPEC－J2 cell

采用10倍倍比稀釋的方法將PCR產物的重組質粒稀釋成系列標準品，以此標準品為模板進行實時定量PCR，每個稀釋度樣品做2個技術性重復，根據閾值循環(Ct)以及相應標準品的稀釋度制作標準曲線。實時定量PCR反應體系如下:SoFastTMEvaGreenSupermix 10.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物 1.0 μL，RNase/DNase－free water 7.0 μL，cDNA 1.0 μL，總體積 20.0 μL;擴增參數為:95 ℃預變性30 s，95℃ 3 s，60～65℃(具體參考每個基因的退火溫度)3 s，40個循環;溶解曲線參數為:65～95℃，每5 s上升0.5℃。所有基因表達量均以β－肌動蛋白為內參基因，以相對表達量來表示，相對定量數據的計算采用Pfaffl［13］建立的方法。

1.3 數據分析處理

數據采用Excel進行整理，以平均值±標準誤表示。采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，采用GLM下Univariate程序進行雙因素方差分析。

2 結果

蘇氨酸對體外培養感染PRV的IPEC－J2細胞免疫相關基因表達的影響見表3。

表2 實時定量PCR引物序列及參數Table 2 Sequences and parameters of primers for the real－time PCR

IL－1β mRNA檢測結果顯示:與對照組相比，PRV感染顯著降低了Ⅰ組 IL－1β mRNA表達量(P=0.040)，時間(P=0.127)、時間與PRV感染交互作用(P=0.333)的影響均不顯著;PRV感染極顯著降低了Ⅱ組 IL－1β mRNA表達量(P=0.001)，時間(P=0.051)、時間與PRV感染交互作用(P=0.165)的影響均不顯著;隨培養時間增加，Ⅲ組IL－1β mRNA表達量極顯著地提高(P=0.000)，PRV感染極顯著降低了IL－1β mRNA表達量(P=0.002)，時間與PRV感染交互作用的影響極顯著(P=0.005)。PRV感染的3組相比，隨時間增加，IL－1β mRNA表達量極顯著地提高(P=0.000);蘇氨酸水平(P=0.830)、時間與蘇氨酸水平交互作用(P=0.249)的影響均不顯著。

IL－6 mRNA檢測結果顯示:與對照組相比，時間(P=0.090)、PRV 感染(P=0.162)、時間與PRV感染交互作用(P=0.075)對Ⅰ組 IL－6 mRNA表達量的影響均不顯著;隨培養時間增加，Ⅱ組IL－6 mRNA表達量極顯著地先升高后降低(P=0.014)，PRV感染(P=0.619)、時間與PRV感染交互作用(P=0.812)的影響均不顯著;隨培養時間增加，Ⅲ組IL－6 mRNA表達量極顯著地先升高后降低(P=0.000)，PRV感染(P=0.346)、時間與PRV感染交互作用(P=0.142)的影響均不顯著。PRV感染的3組相比，時間的影響不顯著(P=0.587);隨蘇氨酸水平增加，IL－6 mRNA表達量極顯著地先升高后降低(P=0.002);時間與蘇氨酸水平交互作用的影響顯著(P=0.012)。

IL－15 mRNA檢測結果顯示:與對照組相比，時間均極顯著先升高后降低3個試驗組的IL－15 mRNA表達量(P=0.000)，PRV感染均極顯著提高了 IL－15 mRNA 表達量(P=0.000)，時間與PRV感染交互作用亦均極顯著(P=0.000)。PRV感染的3組相比，隨培養時間增加，IL－15 mRNA表達量極顯著地先升高后降低(P=0.000);隨蘇氨酸水平升高，IL－15 mRNA表達量極顯著地提高(P=0.000);時間與蘇氨酸水平交互作用的影響亦極顯著(P=0.000)。

TNF－α mRNA檢測結果顯示:與對照組相比，PRV感染極顯著提高了Ⅰ組TNF－α mRNA表達量(P=0.000)，時間(P=0.451)、時間與PRV感染交互作用(P=0.072)的影響均不顯著;時間(P=0.002)的增加、PRV感染(P=0.000)均極顯著提高了Ⅱ組TNF－α mRNA表達量，時間與PRV感染交互作用的影響顯著(P=0.043);時間(P=0.034)的增加、PRV感染(P=0.000)分別顯著、極顯著提高了Ⅲ組TNF－α mRNA表達量，時間與PRV感染交互作用的影響不顯著(P=0.106)。PRV感染的3組相比，隨培養時間增加，TNF－α mRNA表達量極顯著地先提高后降低(P=0.001);蘇氨酸水平(P=0.113)、時間與蘇氨酸水平交互作用(P=0.195)的影響均不顯著。

TGF－β1 mRNA檢測結果顯示:與對照組相比，隨培養時間增加，Ⅰ組TGF－β1 mRNA表達量極顯著地提高(P=0.000)，PRV感染極顯著提高了 TGF－β1 mRNA 表達量(P=0.006)，時間與PRV感染交互作用顯著(P=0.042);隨培養時間增加，Ⅱ組TGF－β1 mRNA表達量極顯著地提高(P=0.001)，PRV感染(P=0.804)、時間與PRV感染交互作用(P=0.201)的影響均不顯著;隨培養時間增加，Ⅲ組TGF－β1 mRNA表達量極顯著地提高(P=0.000)，PRV感染影響不顯著(P=0.197)，時間與PRV感染交互作用的影響極顯著(P=0.001)。PRV感染的3組相比，隨培養時間增加，TGF－β1 mRNA表達量極顯著地先升高后降低(P=0.000);蘇氨酸水平的影響不顯著(P=0.055)，時間與蘇氨酸水平交互作用的影響顯著(P=0.015)。

表3 蘇氨酸對體外培養感染偽狂犬病毒的IPEC－J2細胞免疫相關基因表達的影響Table 2 Effects of Thr on immune－related gene expression of IPEC－J2 cell infected with pseudorabies virus in vitro

3 討論

3.1 關于細胞模型的選擇

機體胃腸道系統的單層上皮細胞起到重要的物理屏障作用，限制胃腸道中潛在有害微生物與腸道黏膜層外部分的接觸。黏膜蛋白是機體先天免疫反應的重要物質，黏膜防御的初級防線，而胃腸道上皮細胞就覆蓋1層豐富的黏膜蛋白，因此研究人員認為上皮細胞介導了先天免疫的早期反應［14］。因此，推測上皮細胞是目前研究營養物質與先天免疫關系可行性較高的細胞模型。文獻報道顯示，目前僅有3種永恒傳代的豬腸道細胞株:IPEC－1、IPEC－J2［15］和 轉 化 細 胞 系 IPI－2I［16］。IPEC－J2是非轉化、非致瘤腸上皮細胞株，保持了天然分化特性并呈現與原始腸上皮細胞高度相似性［9］，因此作者認為IPEC－J2是研究營養物質與腸道細胞免疫關系優秀的細胞株。

3.2 補充蘇氨酸對感染PRV的IPEC－J2細胞基因表達的影響

豬群偽狂犬病、豬瘟等烈性疫病對規模化養豬造成重大經濟損失，改善飼喂模式、增強遺傳抗病力、提高抵抗力和病原感染抵御能力是保障生產的關鍵。從營養的角度來看，飼料組成(氨基酸、能量和酶類)應能夠提供激活相應反應的必需成分。蘇氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸是豬非必需限制性氨基酸，豬群只能通過飼料來源獲得這些氨基酸。蘇氨酸對豬消化、免疫以及生殖系統生理功能均有重要作用［17］，因此研究特殊的生理狀態——病原微生物攻擊下，蘇氨酸水平與免疫的關系具有重要意義。Wang等［18］研究顯示，無論是飼糧蘇氨酸過高還是不足，均減少了育肥豬機體生長組織蛋白質的合成，不利于機體健康。本研究選擇IPEC－J2細胞模型，考察補充添加不同水平的蘇氨酸對先天免疫相關基因表達的影響，從分子水平深入理解蘇氨酸對豬小腸上皮細胞免疫功能的影響。

白介素1(IL－1)是一種炎癥和免疫源性細胞因子，既能協同其他細胞因子促進B細胞與T細胞的活化還能誘導其他炎性因子的產生、黏附分子的表達、白細胞浸潤的增加、誘導興奮性氨基酸和自由基的產生，啟動多種細胞因子級聯反應等［19］。本試驗結果表明，Ⅰ組與對照組相比，PRV感染下調IL－1β mRNA表達，隨時間推移下調強度減弱;PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸加強PRV感染下調IL－1β mRNA表達的趨勢，且高水平(160.35 mg/L)蘇氨酸在1、6 h加強強度大于低(53.45 mg/L)、中水平(106.90 mg/L)，在12 h加強強度小于低、中水平，24 h則表現為略有上調趨勢。上述結果提示，補充高水平蘇氨酸在病毒感染早期抑制IL－1β mRNA的表達，隨后抑制減弱，甚或上調其表達。

IL－6主要由單核細胞、巨噬細胞分泌，很少一部分由上皮細胞、成纖維細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等分泌［20］。IL－6具有復雜的生物學功能，在機體免疫應答中起重要作用，可引起免疫炎癥反應，是一種腸道炎性標記物［21－22］。本試驗結果表明，Ⅰ組與對照組相比，PRV感染在1、6、12 h下調IL－6 mRNA表達，24 h則表現為上調趨勢;PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸緩解PRV感染下調趨勢，在1、6、12 h緩解PRV感染對其下調作用，高水平緩解作用較強，24 h則表現為Ⅰ組上調趨勢，Ⅲ組下調趨勢，Ⅱ組與對照組表達持平。上述結果提示，補充高水平蘇氨酸有利于減緩早期病毒感染腸道細胞致炎性，而后期表達水平的升高極可能源于病毒的過度增殖。

IL－15具有廣泛的生物學功能，被視作先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁因子之一［23－24］，在宿主抗病毒感染和惡性轉化的早期防御方面起重要作用［25］。IL－15在機體組織中分布極為廣泛，Grabstein等［26］采用Northern印跡法分析了各種組織和細胞中IL－15 mRNA的表達，結果顯示其在人胎盤和骨骼肌中表達最豐富，在人心、肺、腎、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、成纖維細胞、上皮細胞及骨髓基質細胞中也有不同程度的表達。Ashkar等［27－28］通過對小鼠的研究證實，IL－15 在機體先天性保護免受人Ⅱ型生殖器單純皰疹病毒感染中起關鍵性作用。本試驗結果表明，Ⅰ組與對照組相比，PRV感染上調IL－15 mRNA表達，隨培養時間增加上調強度先強后弱;PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸有加強PRV感染的上調趨勢，在6、12、24 h呈現濃度效應，其中6 h效果最為明顯。上述結果提示，蘇氨酸可上調IL－15 mRNA表達水平，發揮其抗病毒感染生物學效應。

TNF－α來源極廣泛，體內的多種細胞均具有產生和釋放TNF－α的能力［29］。隨著研究的深入，TNF－α在抗感染方面的作用受到廣泛關注，腸道疾病能發生時，促炎細胞因子的生成明顯增加，其中TNF－α是一種重要的炎癥遞質，在啟動和維持腸組織炎癥中起著非常重要的作用［30］。TNF－α具有雙重生物學效應，是維持動物機體自穩、抵御各種致病因子必不可少的免疫調節因子。在低濃度時，主要作為細胞自分泌及旁分泌的調節物，參與抵抗細菌、病毒和寄生蟲的感染，促進組織修復及調節炎癥反應等;在高濃度時，TNF－α在體內的大量產生和釋放則會破壞機體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產生多種病理損傷。本試驗結果表明，Ⅰ組與對照組相比，PRV感染對TNF－α mRNA的表達具有較強上調作用，隨培養時間增加上調趨勢先強后弱再強;PRV感染的3組相比，添加蘇氨酸緩解PRV感染的上調趨勢，Ⅱ組、Ⅲ組在1、24 h緩解強度大于Ⅰ組，在6 h則表現為緩解強度小于后者，在12 h緩解強度表現為Ⅰ組與Ⅲ組無顯著差異，且小于Ⅱ組。目前發現的促炎細胞因子包括 IL－1、IL－6 和 TNF－α，其中最重要的促炎細胞因子是IL－1和TNF－α，本試驗結果提示，補充高水平蘇氨酸可能延緩或阻抑PRV感染IPEC－J2細胞的炎癥效應，這與IL－1β mRNA表達變化基本一致。

TGF－β在體內外具有廣泛的生物學功能，在維持細胞增殖、分化和凋亡平衡等方面具有十分重要的作用［31］。TGF－β在其基因家族中研究較為清楚，生長抑制是TGF－β特有的性質，TGF－β對大多數細胞的增殖具有抑制作用，尤其是上皮細胞、內皮細胞、淋巴樣細胞和造血細胞。Moses等［32］通過系統性研究證實，在正常情況下TGF－β1的作用主要是抑制上皮細胞增殖。Bai等［33］研究認為，TGF－β1 在凋亡蛋白(Fas)/凋亡蛋白配體(FasL)誘導的肺上皮細胞凋亡中發揮著雙重作用，當使用TGF－β1和FasL聯合處理或使用FasL、TGF－β1依次處理后，肺上皮細胞A549凋亡顯著增強;然而，使用TGF－β1延續持續處理肺上皮細胞A549，結果導致顯著抑制Fas/FasL誘導的細胞凋亡效應。本試驗結果表明，Ⅰ組與對照組相比，PRV感染后1、6 h對TGF－β1 mRNA表達無顯著影響，PRV感染后12、24 h上調其表達;PRV感染的3組相比，添加高水平蘇氨酸在1 h下調其表達且呈濃度效應，在6 h對其表達無顯著影響，Ⅲ組在12 h表現加強PRV感染后上調其表達，Ⅱ組、Ⅲ組在24 h對PRV感染后上調表達有較強的緩解。上述結果提示，補充高水平蘇氨酸抑制TGF－β1 mRNA表達，有利于IPEC－J2細胞增殖，抵抗病毒感染。

4 結論

補充蘇氨酸對感染PRV的IPEC－J2細胞先天性免疫功能具有分子表達水平的調控作用，總體上能夠抑制 IL－1β、TNF－α、TGF－β1 基因表達，加強IL－6、IL－15基因表達，但影響具有時間效應。致 謝

本試驗工作在四川農業大學動物醫學院預防獸醫學實驗室完成，特此感謝郭萬柱教授提供的試驗條件及PRV。本試驗選用的IPEC－J2細胞，由丹麥哥本哈根大學生命科學院人類營養系Per Torp Sangild教授惠贈，特別感謝！

［1］ ROSE W C.Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids.Ⅰ.The inadequacy of diets containing nineteen amino acids［J］.The Journal of Biological Chemistry，1931，94:155 －165.

［2］ MCCOY R H，MEYER C E，ROSE W C.Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids.Ⅷ.Isolation and identification of a new essential amino acid［J］.The Journal of Biological Chemistry，1935，112:283 －302.

［3］ SIMONI R D，HILL R L，VAUGHAN M.The discovery of the amino acid threonine:the work of William C.Rose［J］.The Journal of Biological Chemistry，2002，277(37):E25.

［4］ FULLER M F，MILNE A，HARRIS C I，et al.Amino acid losses in ileostomy fluid on a protein－free diet［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1994，59(1):70 －73.

［5］ STOLL B，HENRY J，REEDS P J，et al.Catabolism dominates the first－pass intestinal metabolism of dietary essential amino acids in milk protein－fed piglets［J］.The Journal of Nutrition，1998，128(3):606 －614.

［6］ WANG X，QIAO S Y，LIU M，et al.Effects of graded levels of true ileal digestible threonine on performance，serum parameters and immune function of 10－25 kg pigs［J］.Animal Feed Science and Technology，2006，129(3/4):264 －278.

［7］ FAURE M，CHONE F，METTRAUX C，et al.Threonine utilization for synthesis of acute phase proteins，intestinal proteins，and mucins is increased during sepsis in rats［J］.The Journal of Nutrition，2007，137(7):1802－1807.

［8］ REMOND D，BUFFIERE C，GODIN J P，et al.Intestinal inflammation increases gastrointestinal threonine uptake and mucin synthesis in enterally fed minipigs［J］.The Journal of Nutrition，2009，139(4):720 －726.

［9］ SCHIERACK P，NORDHOFF M，POLLMANN M，et al.Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for in vitro studies of microbial pathogenesis in swine［J］.Histochemistry and Cell Biology，2006，125(3):293－305.

［10］ NARITA M，KUBO M，FUKUSHO A，et al.Necrotizing enteritis in piglets associated with Aujeszky’s disease virus infection［J］.Veterinary Pathology，1984，21(4):450－452.

［11］ 韓國全.含沙門菌內源啟動子新型雙功能表達載體的構建及其在豬瘟病毒疫苗研究中的應用［D］.博士學位論文.雅安:四川農業大學，2009.

［12］ REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints［J］.American Journal of Hygiene，1938，27(3):493 －497.

［13］ PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic Acids Research，2001，29(9):e45.

［14］ MONCADAD M，KAMMANADIMINTISJ，CHADEE K.Mucin and Toll－like receptors in host defense against intestinal parasites［J］.Trends in Parasitology，2003，19(7):305 －311.

［15］ BERSCHNEIDER H M.Development of normal cultured small intestinal epithelial cell lines which transport Na and Cl［J］.Gastroenterology，1989，96:A41.

［16］ KAEFFER B，BOTTREAU E，VELGE P，et al.Epithelioid and fibroblastic cell lines derived from the ileum of an adult histocompatible miniature boar(d/d haplotype)and immortalized by SV40 plasmid［J］.European Journal of Cell Biology，1993，62(1):152－162.

［17］ LEONARD R P，SPEER V C.Threonine requirement for reproduction in swine［J］.Journal of Animal Science，1983，56(6):1345 －1353.

［18］ WANG X，QIAO S，YIN Y，et al.A deficiency or excess of dietary threonine reduces protein synthesis in jejunum and skeletal muscle of young pigs［J］.The Journal of Nutrition，2007，137(6):1442 －1446.

［19］ CASTELLANOS M，CASTILLO J，GARCIA M M，et al.Inflammation－mediated damage in progressing lacunar infarctions:a potential therapeutic target［J］.Stroke，2002，33(4):982 －987.

［20］ VAN SNICK J.Interleukin－6:an overview［J］.Annual Review of Immunology，1990，8:253 －278.

［21］ RADDATZ D，BOCKEMUHL M，RAMADORI G.Quantitative measurement of cytokine mRNA in inflammatory bowel disease:relation to clinical and endoscopic activity and outcome［J］.European Journal of Gastroenterology ＆ Hepatology，2005，17(5):547－557.

［22］ TURKAY C，KASAPOGLU B.Noninvasive methods in evaluation of inflammatory bowel disease:where do we stand now?An update［J］.Clinics(Sao Paulo)，2010，65(2):221 －231.

［23］ HIROMATSU T，YAJIMA T，MATSUGUCHI T，et al.Overexpression of interleukin－15 protects against Escherichia coli－induced shock accompanied by inhibition of tumor necrosis factor－alpha－induced apoptosis［J］.Journal of Infectious Diseases，2003，187(9):1442－1451.

［24］ YAJIMA T，NISHIMURA H，ISHIMITSU R，et al.Overexpression of IL－15 in vivo increases antigendriven memory CD8+T cells following a microbe exposure［J］.The Journal of Immunology，2002，168(3):1198－1203.

［25］ RODELLA L，ZAMAI L，REZZANI R，et al.Interleukin 2 and interleukin 15 differentially predispose natural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells［J］.British Journal of Haematology，2001，115(2):442 －450.

［26］ GRABSTEIN K H，EISENMAN J，SHANEBECK K，et al.Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin－2 receptor［J］.Science，1994，264(5161):965 －968.

［27］ ASHKAR A A，BLACK G P，WEI Q，et al.Assessment of requirements for IL－15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy［J］.The Journal of Immunology，2003，171(6):2937 －2944.

［28］ ASHKAR A A，ROSENTHAL K L.Interleukin－15 and natural killer and NKT cells play a critical role in innate protection against genital herpes simplex virus type 2 infection［J］.Journal of Virology，2003，77(18):10168－10171.

［29］ KAPADIA S，LEE J，TORRE－AMIONE G，et al.Tumor necrosis factor－alpha gene and protein expression in adult feline myocardium after endotoxin administration［J］.Journal of Clinical Investigation，1995，96(2):1042 －1052.

［30］ SU C，SALZBERG B A，LEWIS J D，et al.Efficacy of anti－tumor necrosis factor therapy in patients with ulcerative colitis［J］.The American Journal of Gastroenterology，2002，97(10):2577 －2584.

［31］ MOSES H L，YANG E Y，PIETENPOL J A.TGF－beta stimulation and inhibition of cell proliferation:new mechanistic insights［J］.Cell，1990，63(2):245 －247.

［32］ MOSES H L，ARTEAGA C L，ALEXANDROW M G，et al.TGF beta regulation of cell proliferation［J］.Princess Takamatsu Symp，1994，24:250 －263.

［33］ BAI L，YU Z，WANG C，et al.Dual role of TGF－beta1 on Fas－induced apoptosis in lung epithelial cells［J］.Respiratory Physiology ＆ Neurobiology，2011，177(3):241－246.