奶牛瘤胃亞急性酸中毒的產生原因和營養學控制方法

周 俊 章 森 董國忠

(西南大學動物科技學院，重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400716)

為滿足奶牛高泌乳的能量需要，高精、低粗的飼糧結構被廣泛應用。高精飼糧在提高奶牛生產性能的同時也引發了一些健康問題。瘤胃亞急性酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)是早期泌乳奶牛和高產奶牛的一種常見營養代謝病。盡管對SARA還沒有統一的定義，但大多數學者仍以瘤胃液pH＜5.6作為判斷標準［1－4］。當使用高精飼糧誘發奶牛發生SARA時，胃腸道中細菌內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)含量顯著升高，這源于瘤胃中革蘭氏陰性菌劇烈的動態變化。高濃度的LPS從胃腸道轉運至體內可刺激促炎性細胞因子的產生，繼而刺激肝細胞分泌急性期蛋白，引發急性期反應。當奶牛發生全身炎性反應時，血漿礦物質和代謝物受到干擾，乳腺合成乳脂肪的能力下降，產奶量降低，從而嚴重影響奶牛的生產性能［5］。本文先對 LPS在體內的代謝過程進行綜述，然后根據最新的研究報道，重點介紹一些減少LPS產生和轉運的新方法，旨在為控制或減少SARA時內毒素對奶牛的危害提供參考。

1 奶牛瘤胃亞急性酸中毒的產生原因

1.1 飼喂高精飼糧時瘤胃中LPS積聚源于微生物區系劇烈變化

高精飼糧中碳水化合物發酵產生大量揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)［6］。VFA 在瘤胃中大量蓄積造成瘤胃液pH下降，滲透壓升高。升高的滲透壓不利于瘤胃壁對VFA的吸收，使pH進一步下降，最終導致SARA發生。使用高精飼糧誘發奶牛發生SARA時，瘤胃中會產生大量有毒有害物質，特別是LPS(表1)。Gozho等［7］研究得出飼糧精飼料比例(x，%)與瘤胃液內毒素LPS濃度(y，log10EU/mL)的關系式為:y=0.000 09x2+0.002 3x+3.807 1(R2=0.99)。

表1 高精飼糧誘發奶牛亞急性酸中毒后瘤胃液游離脂多糖濃度Table 1 Concentration of free rumen fluid LPS during subacute rumen acidosis induced by high concentrate diet in dairy cows

LPS是革蘭氏陰性菌的細胞壁結構成分，由多糖和脂質共價結合組成。多糖部分主要為O－抗原。O－抗原由50個重復單位的寡糖組成，其結構保守性差，因此具有菌種特異性。脂質A是LPS的毒性成分，其空間構象影響其毒性，不同菌種的毒性不同［9］。諸多學者提出飼糧能通過改變瘤胃微生物區系從而影響瘤胃中 LPS 毒性［2，9－10］。Khafipour等［11］報道瘤胃中大腸桿菌LPS毒性最強。革蘭氏陰性菌在指數生長階段或在溶解后都會釋放出 LPS［12］。Andersen［13］報道高達 60% 的LPS是由于革蘭氏陰性菌的快速生長而產生的。在快速生長期，細菌會釋放自溶酶(autolytic enzymes)來促進生長，但是過量的自溶酶可導致細菌細胞裂解。研究表明，產琥珀酸擬桿菌(Fibrobacter succinogens)在快速生長期自體溶解比例比在靜止期高10倍［12］。

奶牛自身不能分泌纖維素分解酶，它們依靠寄宿在瘤胃的細菌、真菌和原蟲分解纖維素。微生物依靠瘤胃提供的適宜生存場所，利用飼糧營養物質進行自身新陳代謝并為奶牛提供蛋白質、維生素、短鏈脂肪酸等。高精飼糧在滿足奶牛高泌乳能量需要的同時也造成瘤胃粗纖維不足，分解纖維素的微生物受到抑制，發酵碳水化合物的微生物快速生長［14］。發酵產生的大量葡萄糖為微生物的生長提供了足夠的能量和碳源，使瘤胃內幾乎所有微生物生長速度加快，瘤胃微生物區系發生劇烈變化，這是奶牛SARA高發的根本原因［15－16］。

Khafipour等［11］通過給奶牛飼喂高比例的谷物或苜蓿草顆粒飼糧成功誘發了奶牛SARA，并發現不同飼糧結構下瘤胃微生物區系結構差異明顯。他們根據瘤胃液LPS濃度、pH＜5.6的持續時間和血漿結合珠蛋白(haptoglobin，Hp)濃度創造性地將谷物誘發的SARA劃分為嚴重型和溫和型，并指出這2種類型SARA的瘤胃微生物區系結構存在很大差異。Khafipour等［11］同時指出即使采食同一飼糧，在不同階段，瘤胃微生物區系結構也不相同。采食后較短時間內，谷物誘發嚴重型SARA時瘤胃中大腸桿菌、牛鏈球菌最多;谷物誘發溫和型SARA時瘤胃中主要是埃氏巨球形菌;苜蓿草誘發SARA時瘤胃中易北河普氏菌占優勢。采食6 h之后，瘤胃中優勢菌種有所變化。埃氏巨球形菌和牛鏈球菌成為谷物誘發嚴重型SARA的優勢菌;谷物誘發溫和型SARA時埃氏巨球形菌依然是第一優勢菌，第二優勢菌由原來的反芻動物月形單胞菌變為了琥珀酸弧菌;苜蓿草誘發SARA時優勢菌新增了普雷沃氏菌和白色瘤胃球菌。由此可見，飼料原料種類和飼糧精粗比不同均會影響瘤胃微生物區系的動態變化，這種動態變化越劇烈革蘭氏陰性菌釋放的LPS就越多，瘤胃中積聚的LPS也隨之增加。

1.2 LPS從胃腸道轉運至體內導致奶牛生產性能下降

正常情況下胃腸道能通過上皮細胞屏障將絕大多數 LPS束縛于消化道內［17］，只有極少量的LPS能通過上皮細胞膜內吞作用或者緊密連接轉運至肝臟并迅速被肝臟清除［9］。在生理或心理應激下，緊密連接屏障功能下降，上皮細胞通透性增加，LPS轉運量增多。奶牛發生SARA時，瘤胃液低pH和高滲透壓進一步破壞上皮細胞角質層，LPS乘機通過瘤胃壁上皮細胞屏障進入體循環以及肝、脾、肺等遠隔器官［18］。

進入血液的 LPS與 LPS結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結合形成復合物(LPS－LBP)，這有助于LPS附著于巨噬細胞表面，使細胞對LPS的敏感性升高，促進脂蛋白對LPS的轉運。LPS－LBP復合物隨后與其特異受體CD14結合，CD14介導單核/巨噬細胞、內皮細胞等識別LPS，再通過Toll樣受體如Toll樣受體－4(TLR－4)介導一系列細胞內信號傳導機制，使細胞漿內轉錄因子如核因子 － κB(NF－κB)磷酸化［18］。NF－κB由胞漿進入細胞核，并結合于基因的啟動區域，激發相關基因的轉錄、翻譯等過程，釋放出大量的細胞因子，如腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白介素 －1(IL－1)和 IL－6 等［18］。過量分泌的細胞因子會引起擴大的炎癥連鎖反應，造成細胞廣泛損傷。例如，TNF－α可刺激血管內皮細胞釋放組織因子，使微血管凝血活性增強，纖溶活性降低，出現彌漫性血管內凝血。TNF－α還可增強血管內皮細胞以及其他器官組織細胞凋亡速率，直接導致器官功能受損。另外，TNF－α似乎能通過增加肌球蛋白輕鏈激酶的表達來增強肌漿球蛋白輕鏈的磷酸化作用，使緊密連接功能下降，LPS滲透性增加［19］。IL－1可使毛細血管滲透性增加，引起機體發熱，誘導肝細胞合成急性期蛋白質，如LPB、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、Hp和C－反應蛋白(CRP)等。

Zebeli等［20］報道，奶牛采食高精飼糧可導致瘤胃液LPS濃度升高，血漿SAA和CRP水平上升，血漿中鈣、鐵、鋅和銅含量出現較大波動;血漿中鈣在肝臟清除LPS的過程中大量消耗，低含量的血漿鈣在得不到補充的情況下容易引發奶牛產乳熱。此外，大量的LPS經體循環轉運至全身各器官會造成諸多器官病變，如脂肪肝、蹄葉炎、胎盤滯留、皺胃移位等［21］。另有研究表明，機體發生急性期反應時，脂質和葡萄糖代謝會發生諸多變化，表現為膽固醇合成減少，脂解作用加快，血漿中非酯化脂肪酸(NEFA)濃度增加［15］。Zebeli等［22］指出，全混合日糧(TMR)中精飼料比率達到60%時，血漿葡萄糖和乳酸鹽濃度升高，膽固醇和β－羥丁酸濃度降低，但NEFA變化趨勢與Ametaj等［15］報道不一致。但可以肯定的一點是，奶牛大量采食高精飼糧引發瘤胃SARA后，瘤胃液和血漿中LPS濃度均升高，大量的LPS不能被肝臟完全清除從而引起急性期反應，使奶牛生產性能下降，表現為產奶量降低、乳脂率下降、牛奶能值降低［5］。

2 控制奶牛亞急性酸中毒的營養學方法

奶牛發生SARA時除表現為瘤胃液pH下降以外，還以瘤胃液LPS濃度顯著升高為特征。目前，國內外介紹的SARA防治方法主要是通過改善飼糧精粗比或添加緩沖劑來防止pH驟然下降。但是，在奶牛實際生產中，為了提高產奶量或由于牧草缺乏，減少精飼料的用量往往不太可行。另外，添加緩沖劑的效果也是有限的［23］。本文將以LPS這一關鍵的SARA異常代謝產物為出發點，從減少LPS產生和轉運2個方面闡述一些新方法和新思路。有報道稱接種抗LPS疫苗或者使用免疫調節劑能降低LPS對奶牛的影響，但因其成本太高暫未得到實際應用［24］，因此，本文不做詳細闡述。

2.1 用乳酸處理精飼料以減緩淀粉發酵速度和減少瘤胃液LPS的產生

營養因素是預防或減少奶牛發生SARA時需要考慮的關鍵因素。在滿足奶牛高泌乳能量需要的同時如何有效預防或減少SARA的發生是一項巨大的挑戰。人們想通過對飼糧的各種加工技術，包括機械處理、熱處理和化學處理來實現這一目的。其中化學處理的方法多種多樣，包括氫氧化鈉、甲醛、氨等處理。由于以上處理方法花費高或者對人和動物健康有害而未得到廣泛應用。

目前，Iqbal等［25－26］研制出了一種便宜、安全、實用的精飼料處理方法，即乳酸處理法。乳酸是一種非腐蝕性有機弱酸，它能改變淀粉結構使其在瘤胃不易消化。這種處理的方法是在精飼料中加入同體積的水，然后加入0.5% ～1.0%的乳酸浸泡一段時間或者于55℃熱處理48 h，處理結束后配成TMR飼喂。采用這種方法可以降低谷物在瘤胃中的發酵速率，增加過瘤胃淀粉的含量，從而有效降低瘤胃液VFA濃度，使瘤胃液pH維持在較高水平。較高的pH使革蘭氏陰性菌保持相對穩定，因此，瘤胃中產生的LPS就較少。此外，高pH有利于瘤胃壁對LPS的屏障作用。Iqbal等［25－26］同時指出長期飼喂乳酸浸泡的谷物對奶牛也無不利影響。飼糧中經乳酸處理的精飼料含量即使達到干物質的45%也不會誘發SARA，相反，奶牛體況、乳脂率、產奶量、利用年限等都將得到提升。谷物經乳酸處理后在瘤胃的消化率降低，發酵速度減緩，這是因為谷物經乳酸處理后產生了超過17%的抗性淀粉［25］。與未經處理的谷物相比，可溶性淀粉含量降低了8%，瘤胃降解時間延長，因此瘤胃液pH一直維持在較高水平，奶牛患SARA的風險降低。另外，乳酸浸泡可降低脂肪氧化速率，增加谷物顆粒中礦物質的利用效率［25］。谷物經乳酸浸泡并加熱處理進一步放大了這種有利變化，谷物中抗性淀粉含量增至20%［26］，瘤胃內環境得到進一步改善。飼喂乳酸熱處理谷物與對照相比即使在采食后10～12 h的最強發酵期也有較高的pH，同時瘤胃液乙酸和丁酸比例較高。乙酸和丁酸是乳腺合成乳脂肪的前體物，其濃度升高有助于提高牛奶乳脂率。

2.2 使用吸附劑吸附LPS以減少其在胃腸道的吸收

奶牛發生SARA時，消化道內高濃度的LPS很容易突破胃腸道屏障轉運入血。使用吸附劑可抑制LPS的遷移，從而減少其在胃腸道的吸收和轉運。吸附劑中能與脂質A結合的吸附劑較好，因為不同來源的LPS脂質A變異最小，且其毒性最強［9］。

黏土礦物(硅酸鹽)是一種純天然物質，因其具有較大的表面積，已被成功用于吸附霉菌毒素，以防止因飼料污染而引起的豬、牛和家禽的健康問題［27］。黏土礦物具有多層結構，單位體積表面積巨大，另外，層與層之間帶有正電荷，對許多毒素具有吸附作用。蒙脫石(montmorillonite)又名微晶高嶺石，是顆粒為0.2～1.0 μm的鋁硅酸鹽構成的礦物質。蒙脫石具有層間可交換陽離子，因此能吸附帶負電荷的離子和有機元素，如LPS［28］。蒙脫石吸水膨脹可超過原體積的幾倍，有利于增加內部表面積，因此具有極大的吸附能力。Ditter等［29］用內臟提取的LPS開展了多種吸附劑對LPS吸附效果的離體試驗和小鼠活體試驗，試驗表明膨潤土(主要成分是蒙脫石)吸附效果最好，且體內試驗和體外試驗表現出較好的一致性。

活性炭(activated charcoal)是一種多孔碳，堆積密度低，比表面積(指單位質量物料所具有的總面積)大，常被用作一種口服毒素吸附劑，用于治療胃腸道炎癥［30］。Steczko 等［31］研究指出，活性炭在體外能夠清除牛血漿中大約1/2的內毒素，相當于每克活性炭能結合50～100 EU內毒素。

黏土礦物和活性炭對LPS的吸附能力被Spieker［32］進行了進一步的試驗驗證。試驗分別使用不同酸度的緩沖液和瘤胃液作為介質，研究pH和培養時間對活性炭和蒙脫石吸附LPS能力的影響。結果表明，不管是在緩沖液還是瘤胃液中，pH對其吸附效果沒有明顯影響，培養時間對其影響較大(圖1)。

以上一系列研究雖已充分說明黏土礦物和活性炭在體外對LPS均有較強的吸附作用，但是其在奶牛消化道內的吸附能力還需活體試驗進一步證實。

圖1 不同緩沖液和瘤胃液中各吸附劑對LPS的吸附率Fig.1 Absorption percentages of LPS by different binders in various buffer solution and rumen fluid

2.3 改善胃腸道的屏障功能以減少LPS的轉運

當奶牛SARA發生時，酸性環境和LPS的存在致使胃腸道黏膜上皮細胞屏障功能受損，滲透性增加［33］。如何維護胃腸道屏障功能是控制或減少LPS危害的一個切入點。據報道，上皮細胞屏障功能與胃腸道中益生菌種類和數量［34－37］以及體內表皮生長因子(EGF)、L－谷氨酸和鋅的水平［19］密切相關。關于奶牛飼糧中添加益生菌的建議早已有之［38－40］。Beauchemin 等［40］建議使用益生菌來代替抗生素，他指出丙酸桿菌能夠將乳酸轉化為丙酸，預防酸中毒。綜合上述文獻，他們都是從益生菌可改善瘤胃微生態的角度來進行闡述的。本文將從益生菌對胃腸道上皮屏障功能保護作用的角度來進行闡述。

益生菌是指能夠利用宿主的營養物質并對宿主的有利作用超過宿主自身利用這些物質的活微生物的總稱［34］。健康狀態下，上皮細胞滲透性由黏膜頂端復合連接體決定，頂端復合連接體是緊密連接和黏著連接的統稱。緊密連接由跨膜蛋白和連接蛋白［如緊密連接蛋白(ZO－1)］構成。常見的跨膜蛋白有閉鎖蛋白(occludin)和水閘蛋白家族(claudins)。當胃腸道發生炎癥反應時，幾種緊密連接蛋白再分配和表達下調是通透性增加的分子機制［34］。胃腸道屏障功能下降的另一因素是上皮細胞凋亡速率升高［34］。據報道，益生菌混合物VSL3(由活的干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜乳酸桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和唾液鏈球菌嗜熱亞種組成)能夠通過維護緊密連接蛋白表達和降低細胞凋亡速率來保護小鼠上皮屏障功能［34］，并且能夠減少促炎性細胞因子分泌［35］。Ichikawa 等［36］和 Madsen 等［37］也得出了和 Mennigen 等［34］一致的結論。

Mennigen等［35］報道益生菌能增強黏液層的保護效應，益生菌黏附在黏膜表面抑制其與致病菌的接觸。此外，益生菌(嗜熱性鏈球菌和嗜酸乳桿菌)可增強閉鎖蛋白和連接蛋白ZO－1的磷酸化作用［35，41］。另有文獻指出益生菌有可能通過誘導產生抗菌肽(如防御素)和抑制致病菌增殖來維護腸道正常的屏障功能。乳酸桿菌和VSL3混合物可以通過誘導產生轉錄因子NF－κB家族、活化蛋白1(AP－1)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)來增強β防御素2的表達［41］。

目前，益生菌調節腸道屏障功能的準確機制仍不十分清楚。益生菌潛在的有利作用包括維持緊密連接蛋白表達、抑制上皮細胞凋亡、減少致病菌黏附、減少促炎性細胞因子分泌、刺激黏液產生［35］和增加防御素分泌等。值得注意的是，Emmanuel等［42］直接給公牛飼喂益生菌后引起了機體急性期反應，細胞因子(IL－1、IL－6、THF－α)分泌增加，但所用菌種不同，對SAA、Hp和LBP的影響不一致。Emmanuel等［43］在高精飼糧條件下直接飼喂活屎腸球菌未對急性期蛋白［SAA、LBP、Hp和α1酸性糖蛋白(α1－AGP)］濃度產生影響，但同時飼喂活屎腸球菌和酵母菌提高了血漿中SAA、LBP和Hp濃度。這個現象出現可能是因為益生菌不同或者益生菌之間的互作改變了某些生理狀態。因此，益生菌對奶牛胃腸道上皮屏障功能的保護作用仍需進一步的研究。

EGF具有促進胃腸道黏膜生長和分化的功能。有研究指出當大量酗酒時，乙醇代謝產生的大量乙醛可增加胃腸道對LPS的滲透性，當有EGF存在時，滲透性增加的程度明顯降低［19］。這是因為EGF可阻止乙醛引起的閉鎖蛋白、ZO－1、E－降鈣蛋白和β－連環蛋白的重分配，另外，EGF可防止肌動蛋白細胞骨架重組，保護閉鎖蛋白、ZO－1、E－降鈣蛋白和β－連環蛋白與肌動蛋白細胞骨架之間的相互作用。進一步的研究表明EGF通過依賴磷脂酶 Cγ1(PLCγ1)、鈣、蛋白激酶 Cβ1(PKCβ1)和蛋白激酶Cε(PKCε)途徑來保護緊密連接屏障功能［19］。當短發夾 RNA(shRNA)中PLCγ1基因被撬除時，EGF介導的保護作用減弱。EGF可通過依賴 PLCγ1途徑誘導 PKCβ1和PKCε的跨膜轉運。PKCβ1和PKCε跨膜轉運可有效預防乙醛導致的滲透性增加。此外，體內L－谷氨酸和鋅水平也會影響上皮屏障功能。L－谷氨酸雖是一種非必須氨基酸，但具有改善上皮屏障功能的作用。L－谷氨酸能增加LPS跨上皮細胞轉運電阻，抑制細胞間連接和細胞內區域間閉鎖蛋白、ZO－1、E－降鈣蛋白和β－連環蛋白的重分配，減少閉鎖蛋白、ZO－1、E－降鈣蛋白和β－連環蛋白從肌動蛋白細胞骨架中解離［19］，從而增強上皮屏障功能。鋅主要通過抑制胃腸道上皮細胞炎癥反應增強其屏障功能［19］。以上研究雖已說明EGF、L－谷氨酸和鋅具有保護上皮屏障的功能，但是這些研究都是基于乙醛致使的屏障功能受損模型。新的研究仍需開展以證實奶牛發生SARA時EGF、L－谷氨酸和鋅對胃腸道黏膜上皮細胞屏障的保護作用。

3 小結

高精飼糧在滿足奶牛高泌乳能量需要的同時破壞了瘤胃內環境的穩定。奶牛采食大量易發酵碳水化合物后瘤胃中微生物區系改變，揮發性脂肪酸濃度增加，瘤胃液pH下降，從而引起瘤胃亞急性酸中毒。代謝異常的微生物產生大量LPS。LPS轉運至體內會引起全身炎性反應，改變血漿代謝物和礦物質水平，從而使奶牛生產性能下降。精飼料經乳酸浸泡后在瘤胃發酵速度減慢，這有利于維持瘤胃微生物區系相對穩定，減少LPS的產生。胃腸道中大量游離的LPS可以使用吸附劑進行吸附，也可以通過增強上皮細胞屏障功能減少轉運至體內的LPS量，從而減輕亞急性酸中毒時LPS對奶牛的危害。

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