中國人非小細胞肺癌B-RAF基因（V600E）突變的研究

翟篤明，王松林，賈淞淋，郭成業

（1.長春市中心醫院 胸心外科，吉林 長春 130051；2.長春市醫學高等專科學校，吉林 長春 130031）

中國人非小細胞肺癌B-RAF基因（V600E）突變的研究

翟篤明1，王松林2，賈淞淋1，郭成業1

（1.長春市中心醫院 胸心外科，吉林 長春 130051；2.長春市醫學高等專科學校，吉林 長春 130031）

鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因編碼的蛋白為 M a PK通路中的絲氨酸蘇氮酸蛋白激酶，該酶將信號從RAS轉導至EKI／2，從而參與調控多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。BRAF在多種腫瘤存在突變，其中以結直腸癌突變率最高，突變率約為15%左右，在惡性黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌，肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突變［1，2］。BRAF基因的突變位點主要位于基因的第15外顯子，其中約92%位于第1799位核苷酸上（T突變為A），導致其編碼的谷氨酸被解氨酸取代（V600E）［3］。

在非小細胞肺癌進行針對表皮生長因子受體（epidermal growth factorreceptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase Inhibitors，TKIs）進行的小分子靶向藥物（易瑞沙，特羅凱）治療的過程中發現：在K-RAS沒有突變的患者中也產生了針對靶向藥物的抗性，研究發現部分與B-RAF基因（V600E）突變有關［4］，因此在進行肺癌靶向治療前進行B-RAF基因突變的檢測對于判別治療藥物的敏感性有一定的指導意義。當前對于B-RAF基因（V600E）在我國非小細胞肺癌組織突變的情況還未見研究報道，因此本研究針對160例非小細胞肺癌組織進行突變檢測，并分析突變與臨床聯系，有助于篩選出適合非小細胞肺癌靶向治療的人群。

1 材料與方法

1.1 標本資料

收集160例非小細胞肺癌患者手術后的石蠟標本。在160例患者中，女性50例（31.25%），男性110例（68.75%）；年齡35歲－88歲，中位年齡為60歲；吸煙患者100例（62.50%），不吸煙患者60例（37.50%）；病理類型：腺癌81例（50.63%），鱗癌64例（40.00%），腺鱗癌15例（9.47%）；Ⅰ期33例（20.63%），Ⅱ 期 32 例 （20.00%），Ⅲ 期 82 例（51.25%），Ⅳ期13例（8.12%）；腫瘤分化程度：低分化77例（48.13%），中、高分化83例（51.87%），所有病理學類型及TNM分期均按照WHO標準。

1.2 B-RAF基因（V600E）突變測序分析

應用石蠟切片DNA提取試劑盒（FFPE gDNA miniPREP KIT，BIOMIGA）進行腫瘤組織DNA提取。以提取的DNA為模板進行B-RAF基因第15顯子擴增。擴增引物為：上游引物：CCTCATCCTAACACATTCAAGCC， 下 游 引 物：CTTTCTAGTAACTCAGCAGCCATCTC，PCR產物長度為426bp。PCR反應體系為20μl，包括：3.0μl DNA（0.2μg），1μl primer（10μmol），10μl 2×HotStart Taq PCR MasterMIX（北京天根公司），6μl DEPC-treated water。PCR 產 物 應 用ABI3130型遺傳學分析儀測序，測序引物為PCR擴增上游引物。

1.3 統計學分析

應用Fisher’s檢驗分析了K-RAS基因突變與性別、組織學類型和吸煙狀態、分化程度及分期之間的關系，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 B-RAF基因（V600E）的突變檢測情況

通過PCR擴增反應，所用檢測對象均可以擴增出B-RAF基因的第15外顯子基因片段，其片段大小在426bp（結果見圖1A）。以PCR產物為模板，應用ABI3130測序儀進行基因測序，測序結果通過分析發現在檢測的樣本內檢測到B-RAF基因的野生型（GTG，V）以及突變型（GAG，E）分布，突變型均為雜合性突變（結果見圖1B，1C），在160例患者中，8例患者存在突變，占5%。

2.2 B-RAF基因突變同患者臨床特點之間的關系

在8例發生B-RAF基因突變的患者中，6例為腺癌（6／81；7.14%），2例為鱗癌（2／84；3.12%）；7例為女性（7／50；14%），1例為男性（1／110；0.9%）；4例為吸煙者（4／100；4%），3例為非吸煙者（3／60；5%）。B-RAF基因突變同性別有關，女性患者突變率明顯高于男性。B-RAF基因突變與腫瘤細胞的分化有關，低分化腫瘤該基因的突變率明顯高于中高分化的腫瘤組織。該基因的突變與病理類型、吸煙情況以及分期均無相關性。結果見表1。

圖1 B-RAF基因（V600E）的突變檢測結果

表1 BRAF基因突變與臨床特點關系

3 討論

B-RAF基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤因肉瘤中發現并克隆確認的。B-RAF基因位于7q34，編碼783個氨基酸的蛋白，在絕大多數組織和細胞類型中，B-RAF是MEK／ERK最為關鍵的激活因子。B-RAF蛋白的主要功能為有絲蛋白激酶（MAPK）通路中的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，它將細胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內的轉錄因子相連接，激活多種因子，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。B-RAF基因突變主要有兩種類型：（1）11%的突變位于外顯子11上的甘氨酸環，如G463、G465、G468等點突變；（2）89%的突變發生于外顯子15上的激活區，其中約92%位于第1 799位核苷酸上（T突變為A），導致其編碼的纈氨酸由谷氨酸取代（V600E）。激酶激活后活性比野生型B-RAF提高500倍。突變后的B-RAF持續性激活 MAPK通路，使前有絲分裂原有效分裂能力增強，導致細胞異常增殖和分化［5］。

國外的研究學者發現在非小細胞肺癌的患者腫瘤組織內存在部分的B-RAF基因突變。其突變率大約在3%左右［6］。B-RAF突變與非小細胞肺癌患者的生存率有一定的關系，具有B-RAF基因突變的患者預后較差［7］。在本研究檢測的非小細胞肺癌患者的B-RAF突變發現，B-RAF的突變與性別有關，女性突變的比例明顯高于男性，而我國學者在進行大規模人群EGFR測序以及靶向分子藥物治療相關性中得到的研究結論是在非小細胞肺癌的患者中性別為女性、不吸煙以及病例類型為腺癌的患者其EGFR突變率較高，更適合應用靶向藥物治療［8，9］。而本研究中發現的女性的B-RAF突變率較高，突變率在病理類型以及是否吸煙沒有差異。同時以往的研究表明B-RAF突變可與EGFR基因的突變同時存在，而B-RAF突變的患者將不會從EGFR靶向治療藥物中獲益。因此在進行針對EGFR進行靶向分子治療過程中，應事先進行B-RAF突變的檢測。

當前針對B-RAF（V600E）突變的腫瘤靶向藥物已經進入Ⅰ期臨床研究，顯示良好的臨床效果以及 較 低 的 毒 副 作 用［10，11］。 因 此 針 對 B-RAF（V600E）突變的腫瘤患者在不能應用針對EGFR靶向分子治療的同時，也可以應用針對B-RAF（V600E）突變的靶向藥物。通過針對 B-RAF（V600E）突變的檢測不僅進一步豐富了非小細胞肺癌的分子分型研究，同時也為其治療提供新的治療靶點與策略。

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1007－4287（2012）02－0304－03

2010－12－20）