社區(qū)相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子分型研究

潘宏升，荀鳳嬌，田素飛，年 華，褚云卓＊

（1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 檢 驗科，遼寧 沈 陽110001；2.遼寧省第三人民醫(yī)院 檢 驗科）

目前，全球范圍內(nèi)由社區(qū)相關性耐甲氧西林金黃色 葡 萄 球 菌 （community－associated methicillinresistant Staphylococcus aureus，CA－MRSA）引起的感染呈逐年上升趨勢，CA－MRSA與醫(yī)院相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（hospital－associated methicillin－resistant Staphylococcus aureus ，HAMRSA）存在許多不同，CA－MRSA多感染無相關危險因素的健康人群，且發(fā)病年齡較輕［1］。研究發(fā)現(xiàn)，HA－MRSA與CA－MRSA的mec A基因的葡萄球菌基因盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）的基因型不同，HA－MRSA 多為Ⅰ－Ⅲ，CA－MRSA以Ⅳ、Ⅴ型為主［1］。本文應用SCC－mec基因分型、SPA分型、多位點序列（MLST）分析等方法，從多個角度了解CA－MRSA的分子生物學特點，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2007年1月至2008年9月門診及住院患者連續(xù)分離、不重復非痰標本CAMRSA菌株5例，其中濃汁3份，血液2份，詳細情況見表1。

1.1.2 主要試劑及儀器 細菌基因組提取試劑盒，博日生物技術(shù)有限公司；Tag酶及PCR相關試劑，寶泰克大連生物科技有限公司；PCR引物，上海生工有限公司合成；脈沖場凝膠電泳試劑，美國Bio－Rad生物科技有限公司；PCR9700（Gene Amp）；脈沖場凝膠電泳儀（美國Bio－Rad），HZQ－F160振蕩培養(yǎng)箱（上海）；超速低溫離心機（貝克曼）；紫外凝膠成像儀（美國Alpha Innotech）。

表1 5株CA－MRSA菌株來源的基本情況

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 采用細菌基因組提取試劑盒，按照說明提取基因組DNA。

1.2.2 SCCmec基因分型 引物設計及反應參數(shù)等參 照 文 獻［2］進 行，ClassB 上 游 引 物：5’－TATTTTTGGGTTTCACTCGG－3’，下游引物：5’－CTCCACGTTAATTCCATTAATACC－3’；ClassC上 游 引 物：5’－GAACATTGTTACTTAAATGAGCG－3’，下 游 引 物：5’－TGAAAGTTGTACCCTTGACACC－3’；Type2上游引物：5’－ATTGCCTTGATAATAGCCTCT－3’，下游：5’－TAA AGGCATCAATGCACAAACACT－3’。

1.2.3 基因序列分析 目的基因經(jīng)PCR擴增陽性，片段大小與預計值相符，產(chǎn)物經(jīng)上海生工有限公司純化、測序，在GenBank比對確證，其中SPA分型的測 序 結(jié) 果 于 數(shù) 據(jù) 庫 （http：／／www.ridom.de／spaserver／）中公布的重復序列進行比較，根據(jù)排列方式及次數(shù)確定型別。

1.2.4 多位點序列分型 擴增7個管家基因，引物及反應參數(shù)參照文獻［3］進行，管家基因引物分別如下：arc－up：5’－TTGATTCACCAG CGCGTA TTGTC－3 ’， arc－dn： AGGTATCTGCTTCAATCAGCG；aro－up：5’－ATCGGAAATCCTATTTCACATTC－3’，aro－dn：5’－GGTGTTGTATTAATAACGATATC－3’；glp－up：5’－CATGGAACTGCAATCTTAATCC，glp－dn：5’－TGGTAAAATCG－CATGTCCAATTC－3’；gmk－up：5’－ATCGTTTTATCGGGACCATC－3’，gmk－dn：5’－TCATTAACTACAACGTAATCGTA－3’；pta－up：5’－GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG－3’，pta－dn：5’－GAVCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA－3’；tpi－up：5’－TCGGTCATTCTGAACGTCGTGAA－3’，tpidn：5’－TTTGCACCTTCTAACAATTGT AC－3’；yqi－up：5’－CAGCATACAGGACACCTATTGGC－3’ yqi－dn：5 ’－CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC－3’。測序結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫 （http：／／www.mlst.net），比較每個多態(tài)性位點的等位基因，獲得序列號（ST），與已知的MRSA流行株進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 SCCmec基因分型結(jié)果

5株CA－MRSA克隆株，SCCmec基因型Ⅳ型為3株（60%），Ⅴ型為2株（40%）。

2.2 多位點序列分型結(jié)果

3株SCCmec基因型Ⅳ型克隆株為ST59（19－23－15－2－19－20－15）；Ⅴ型克隆株1株為ST7（5－4－1－4－4－6－3），另1株未能成功進行多位點序列分型。

2.3 SPA基因多態(tài)性分型結(jié)果

3株SCCmec基因型Ⅳ型克隆株歸屬為t437型（r04－r20－r17－r20－r17－r25－r34），Ⅴ型克隆株歸屬為t163型（r04－r20－r17－r20－r17－r45－r16－r34）和t796型（r07－r23－r21－r17－r12－r23－r02－r12－r23）。

表2 5株CA－MRSA基因分型結(jié)果

3 討論

自從1997年在紐約首次發(fā)現(xiàn)社區(qū)相關性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染以來，全球范圍內(nèi)關于CA－MRSA感染的報道接連不斷，其較強的傳播能力和定植能力及其攜帶的毒力基因?qū)τ诩膊〉陌l(fā)生、發(fā)展都起到了十分重要的作用，使其極易造成感染的暴發(fā)和流行，引起發(fā)病率和死亡率升高。

目前，分子流行病學研究方法在揭示病原菌的進化及遺傳特性，確定某一感染暴發(fā)流行菌株或相關基因來源，追蹤基因水平的轉(zhuǎn)移與播散，調(diào)查院內(nèi)耐藥性質(zhì)粒在不同細菌間播散等方面發(fā)揮重要作用。本研究確定應用三種基因分型（PFGE、MLST及SPA）方法，全面揭示CA－MRSA流行株的基因型變化趨勢及流行病學特點，同時還可以為臨床經(jīng)濟、快速、準確確證CA－MRSA感染提供方法學依據(jù)。其中，PFGE方法是進行染色體DNA分型，將基因組的整體基因片段進行分析，主要應用于近期內(nèi)引發(fā)感染疾病的菌株間同源性分析，其分辨能力強，被譽為基因分型技術(shù)的“金標準”；而 MLST揭示的是菌株長期進化、變異的結(jié)果，其主要優(yōu)勢在于己經(jīng)建立了大型數(shù)據(jù)庫，可以直接將結(jié)果提交到國際網(wǎng)站，與已知的流行株進行比較和分析，了解不同國家和地區(qū)間菌株的遺傳相關性［4］；SPA基因分型方法是目前較有效地基因分型工具，操作方便快捷，從另一個角度描繪了CA－MRSA的進化路線［5］。

本次調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，3例SCCmecⅣ－t437型CA－MRSA菌株（P14、2997、E14）的 MLST基因型為ST59，均分離自沈陽及周邊地區(qū)社區(qū)發(fā)病患者，因皮膚軟組織感染而接受治療，與美國、新加坡及中國臺灣地區(qū)廣泛傳播的CA－MRSA菌株屬于同一克隆株［6］。另外兩株 CA－MRSA 菌株為SCCmecⅤ－t796型菌株（b811），MLST基因型為ST7，SCCmecⅤ－t163型菌株（5896）MLST未分出結(jié)果，表明此兩株菌分別由不同菌株進化而來，在本地區(qū)流行傳播，但目前相關報道較少，不排除境外攜帶者傳播的可能性，隨著國家和地區(qū)間經(jīng)濟文化交流的日益頻繁，將會進一步促進CA－MRSA菌株間的互相“流通”，這就使得疾病的傳播和變異進一步復雜化，對人群危害嚴重。

細菌對抗菌藥物的耐藥性不斷增長問題備受世界關注，雖然CA－MRSA菌株在基因結(jié)構(gòu)上僅攜帶對β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的mec A基因，但相關資料表明CA－MRSA菌株對多重藥物敏感率呈逐年降低趨勢［6］，本研究中的5株CA－MRSA菌株不僅對青霉素、紅霉素、頭孢西丁抗菌藥物完全耐藥，對克林霉素及頭孢呋辛耐藥率也較高，而且對環(huán)丙沙星、慶大霉素也有不同程度耐藥，表明本地區(qū)發(fā)現(xiàn)的多重藥物敏感率下降的CA－MRSA克隆株在不斷進化發(fā)展中，適應能力在不斷提高。此外，不容忽視的是CA－MRSA菌株SCCmec基因片段相對小，更容易整合其他耐藥基因，很容易造成大規(guī)模的疾病流行，勢必將醫(yī)學界推向被動局面，形勢不容樂觀。有必要對耐藥菌株進行耐藥監(jiān)測，注意耐藥譜變化，研究其耐藥機制，指導臨床正確選擇抗菌藥物，防止耐藥菌株擴散。

［1］Jenum PA，Walberg M，Rφnning EJ，et al.An outbreak of methicillin－resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward［J］.Tidsskr Nor Laeqeforen，2008，128（8）：933.

［2］Kunyan Zhang，Jo－Ann McClure，Sameer Elsayed，et al.Novel Multiplex PCR Assay for Characterization and Concomitant Subtyping of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Types I to V in Methicillin－Resistant Staphylococcus aureus［J］.JCM，2005，5026.

［3］Mark C，Enright，Nicholas P，et al.Multilocus sequence typing for characterization of methicillin－resistant and methicillin－susceptible clones of Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，2000，38：1008.

［4］Strommenger B，Braulke C，Heuck D，et al.spa Typing of Staphylococcus aureus as a Frontline Tool in Epidemiological Typing［J］.J Clin Microbiol，2008，46：574.

［5］范 紅.三株社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因分型研究［J］.中華醫(yī)學雜志，2008，88：20.

［6］Gorwitz RJ，Jernigan DB，Powers JH，et al.In the CDC－Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community［C］.2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community：summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention.