PI3K與ERK1／2信號傳導通路在吡格列酮保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制

趙永強，雋兆東，管英俊，劉寶堂，王永明

（1.濰坊醫學院附屬醫院 心胸外科，山東 濰坊261031；2.濰坊醫學院 組織學與胚胎學教研室；3.濰坊市第二人民醫院 胸外科）

曹澤玲等［1］研究表明吡格列酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用。王浩等［2］研究顯示吡格列酮通過上調磷酸化ERK1／2表達，從而對大鼠心肌產生保護作用。我們的前期研究也表明吡格列酮通過激活Ras／PI3K／AKT信號轉導通路發揮抗缺血再灌注心肌細胞凋亡作用。但兩信號通路之間是否有聯系以及如何聯系國內尚未見報道。本研究采用培養Wistar大鼠乳鼠心肌細胞的缺氧復氧模型，觀察PI3K與ERK1／2信號通路在吡格列酮介導大鼠心肌缺血再灌注損傷中的聯系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

一日齡Wistar大鼠乳鼠20只（Wistar大鼠由山東魯抗實驗動物中心提供）。

1.2 實驗材料

吡格列酮（朵英），DMEM培養基、0.1%胰蛋白酶液（Solarbio），bs－2637R、bs－3016R免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京博奧森），小鼠抗橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體、蛋白抽提試劑盒、ECL發光液（北京中杉金橋）。

1.3 實驗方法

1.3.1 心肌細胞培養 按王強等［3］原代心肌細胞培養方法，依實驗室條件加以改進。1－2日齡 Wistar大鼠乳鼠無菌條件下開胸取出心臟，剪取心室肌，剪碎至1mm3左右，0.1%的胰蛋白酶液振蕩水浴（37℃）消化10min，沉淀取上清，按1∶1比例加含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基終止消化，以1 000r／m的轉速離心10min，棄上清，DMEM重懸 ，重復至消化完全。收集重懸液，差速貼壁法去除成纖維細胞，用培養基將細胞密度調整至（0.5%－1）×106／ml，接種至培養瓶中，放入培養箱培養，兩天后換液。

1.3.2 分組及模型建立 實驗分為四組：每組5只，大鼠乳鼠取出心臟按上述方法培養出心肌細胞，正常組（Co組）、缺血再灌注組（Ⅰ組）、Ⅰ組＋吡格列酮預處理組（Pi組）、Pi組＋PI3K 抑制劑LY294002組（Pi＋LY組）。四組培養至第4日以后，換無血清低糖DMEM培養過夜。將無血清低糖DMEM培養基置三氣培養箱（37℃，95%N2，5%CO2）無氧預處理30min。棄去原有培養基，加入2 ml預處理培養基，并按分組加入以下試劑：①Ⅰ組：2μl DMSO。②Pi：2μl吡格列酮使用液。③Pi＋LY組：2μl吡格列酮使用液＋2μl LY294002使用液。三組置三氣培養箱（37℃，95%N2，5%CO2）缺氧處理3h，然后換含血清高糖DMEM轉到常氧條件（37℃、5%CO2）復氧處理3h。Co組：2ml含血清高糖DMEM＋2μl DMSO在常氧條件下培養。

1.3.3 免疫細胞化學法檢測ERK1／2、p－ERK1／2細胞爬片長滿80%左右時室溫下冷丙酮固定20 min，PBS洗滌三次，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，37℃山羊血清封閉孵育后，分別滴加ERK1／2、p－ERK1／2抗體（1∶200），濕盒中4℃冰箱過夜，加入過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（1∶500），DAB顯色，鏡下觀察，適時終止反應，脫水透明封片，共聚焦顯微鏡下拍照，Image－pro plus 6.0軟件分析得出 OD值。

1.3.4 Western－blotting定量檢測p－ERK 1／2 細胞經洗滌后加入細胞裂解液，轉移至離心管，超聲破碎。4℃、12 000轉／min離心15min，取上清。取部分樣品酶標儀BCA法測定蛋白質濃度。樣品中加入5×上樣緩沖液，取90μg蛋白用12%SDSPAGE進行電泳。90V恒壓將蛋白轉到硝酸纖維膜（NC膜），轉膜時間90min。室溫下將NC膜用5%脫脂奶粉／0.01mol／L PBS封閉1h。加適當比例稀釋的p－ERK1／2抗體，4℃冰箱孵育過夜。5%脫脂奶粉／0.01mol／L PBS漂洗3次／10min。加通用二抗，室溫孵育2h。0.01mol／L PBS漂洗3次／10min。將化學發光劑ECL的增強液和穩定的過氧化物酶溶液1∶1比例混合后滴加到NC膜上，室溫反應2min。暗室中感光及UVP凝膠成像系統拍照。Quantity One軟件分析條帶，得出光密度OD值。

1.4 統計學處理 應用SPSS 12.0軟件進行統計處理。各組間用單因素方差分析（ANOVA），各組之間的兩兩比較用SNK－q檢驗。P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學法檢測 ERK1／2（圖1）與p－ERK1／2表達（圖2）

ERK1／2在各組中的表達無顯著差異（P＞0.05）；Pi組p－ERK1／2表達明顯高于Ⅰ組與 Pi＋LY組（0.1199±0.0211vs0.0827±0.0089，0.1199±0.0211vs 0.0920±0.0110，P＜0.05），Ⅰ組p－ERK1／2表達也明顯高于 Co組（0.0827±0.0089 vs 0.0669±0.0115，P＜0.05）。

圖1 免疫細胞化學法示ERK1／2（×200）在四組心肌細胞中的陽性表達

2.2 p－ERK1／2蛋白水平的表達變化（圖3）

Western blotting結果顯示，與Ⅰ組與Pi＋LY組相比，Pi組明顯升高（0.8858±0.0474vs0.4906±0.0106，0.8858±0.0474vs0.5630±0.0245，P＜0.05），Ⅰ組表達明顯高于 Co組（0.4906±0.0106 vs0.2707±0.0202，P＜0.05）。

圖2 免疫細胞化學法示p－ERK1／2（×200）在四組心肌細胞中的陽性表達

圖3 四組內p－ERK1／2在蛋白水平的表達變化

3 討論

近年來，隨著溶栓療法、動脈搭橋術、導管技術、經皮腔內冠脈血管成形術、心臟外科體外循環等方法的建立和推廣，使心臟重新獲得血液供應，明顯減輕了細胞損傷，提高了臨床療效。但是，恢復血液再灌注后，患者細胞功能代謝障礙和結構破壞反而加重，因而將這種現象稱為心肌缺血再灌注損傷（ischemia－reperfusion injury）。心肌缺血再灌注損傷的發生機制尚未完全闡明，目前認為細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發病機制中的重要環節之一，主要與活性氧生成、鈣超載、中性粒細胞激活、線粒體損傷等有關［4］。

Hausenloy DJ 等［5］把 PI3K－AKT、ERK1／2、JNK MAPK等信號途徑在缺血再灌注損傷中的激活稱為促生存激酶級聯反應，或再灌注損傷救援激酶途徑。已經證明激活上述再灌注損傷救援激酶可能減輕再灌注損傷中的細胞凋亡。1999年，Matsui T等［6］發現在某些條件下激活PI3K／Akt信號通路可有效抑制低氧誘導的心肌細胞凋亡發生，具有心血管保護作用的因子，如胰島素［6］、促紅細胞生成素［7］、刺五加［8］、瑞舒伐他?。?］等均是通過激活PI3K／Akt通路抑制細胞凋亡發揮心血管保護作用。我們的前期研究表明與缺血再灌注損傷比較，吡格列酮組凋亡指數降低，磷酸化AKT表達明顯增加，但這種變化被PI3K特異性抑制劑LY294002抑制；吡格列酮通過激活Ras／PI3K／AKT信號轉導通路發揮抗缺血再灌注心肌細胞凋亡作用。同樣王浩等［2］對吡格列酮通過ERK1／2信號通路抑制大鼠心肌缺血再灌注對心肌的損傷也進行了比較透徹的研究，研究顯示缺血再灌注后，大鼠心肌磷酸化ERK1／2表達上調，吡格列酮上調磷酸化ERK1／2表達，從而對大鼠心肌產生保護作用。

PI3K和ERK1／2信號通路是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，都調節著細胞生長、凋亡及一些細胞內重要基因的表達。吡格列酮分別通過這兩條通路對大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷產生保護作用的研究比較多，但兩者在吡格列酮產生保護作用中的影響研究甚少。本實驗研究顯示：Pi組p－ERK1／2的表達水平明顯高于Ⅰ組，而這種表達被PI3K特異性抑制劑LY294002抑制，這說明在吡格列酮保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中還存在PI3K／ERK1／2信號傳導通路。這為以后臨床用藥減輕心肌缺血再灌注對心肌的損傷提供了新的靶點。

［1］曹澤玲，葉 平，龍超良，等.吡格列酮對大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中華臨床藥理學與治療學，2005，10（10）：1112.

［2］王 浩.PPARγ激動劑吡格列酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制研究［D］.北京：中國人民解放軍軍醫進修學院，2008.

［3］王 強，王東進，朱凌云，等.改良的原代心肌細胞培養方法［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（6）：1168.

［4］李 凱，鄭世營.心肌缺血再灌注損傷與心肌細胞凋亡的研究進展［J］.醫學綜述，2008，14（1）：6.

［5］Hausenloy DJ，Yellon DM.New directions for protecting the heart against ischemia－reperfusion injury：targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase（RISK）pathway［J］.Cardiovasc Res，2004，61（3）：448.

［6］Matsui T，Li L，del Monte F，et al.Adenoviral gene transfer of activated phosphatidylinositol 3＇－Kinase and Akt inhibits apoptosis of hypoxic cardio－myocytes in vitro［J］.Circulation，1999，100：2373.

［7］Gao F，Gao E，Yue T L，et al.Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia－reperfusion：the roles of PI3－Kinase，Akt，and endothelial nitric oxide synthase phosphory1ation［J］.Circulation，2002，105（12）：1497.

［8］Cai Z，Semenza GL.Phosphatidylinositol－3－Kinase signaling is required for erythropoietin－mediated acute protection against myocardial ischemia／reperfusion injury［J］.Circulation，2004；109（17）：2050.

［9］劉寶堂，雋兆東，陳 峰，等.PI3K／AKT通路在刺五加保護大鼠缺血再灌注心肌細胞損傷中的作用［J］.解剖科學進展，2010，16（3）：249.

［10］Cai W，Fang J，Chen ZY，et al.Rosuvastatin enhances the protective effects of ischemic postconditioning on myocardial ischaemia－reperfusion injury in type 2diabetic rat［J］.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi，2010，38（9）：814.