產ESBLs大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物耐藥基因研究

張淑青

［開灤（集團）有限責任公司醫院，河北 唐山063000］

產ESBLs大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物耐藥基因研究

張淑青

［開灤（集團）有限責任公司醫院，河北 唐山063000］

目的 了解本院產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌對氨基糖苷類的耐藥情況及耐藥基因的表達狀況。方法用聚合酶鏈反應（PCR）法檢測aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-I、ant（2′′）-I、ant（3′′）-I、aac（3）-I等5種氨基糖苷類修飾酶（AMEs）基因。結果在臨床分離的75株大腸埃希菌中共檢出產ESBLs菌47株（62.67%）；產ESBLs菌攜帶AMEs基因檢出情況，陽性率從高到低為：aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-I、ant（2′′）-I、ant（3′′）-I、aac（3）-I。產 ESBLs菌耐藥情況從高到低依次為：鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星。結論大腸埃希菌產ESBLs率顯著升高，耐藥性增加；有些菌株同時攜帶兩種或兩種以上AMEs基因；ESBLs的產生可使大腸埃希菌對氨基糖苷類抗菌藥物（AGs）的耐藥情況加重。

大腸埃希菌；耐藥性；氨基糖苷類修飾酶

（ChinJLabDiagn，2012，16：0299）

超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是一類由細菌質粒介導的β-內酰胺酶，能水解甲氧亞氨基β-內酰胺類抗生素，如青霉素類、頭孢菌素及單環抗生素，其活性能被β-內酰胺酶抑制劑抑制。近年來，大腸埃希菌已成為醫院感染的重要病原菌，隨著抗生素的大量應用，大腸埃希菌產ESBLs菌株逐年增多，ESBLs在菌株間轉移和傳播更增強了細菌的耐藥性，這一現象在臨床已成為突出問題。為了解我院產ESBLs大腸埃希菌AMEs基因存在狀況，我們對臨床分離所得的75株大腸埃希菌產ESBLs情況進行藥敏試驗并檢測了aac（3）－I、aac（3）－Ⅱ、aac（6′）－I ad、aac（6′）－I d、aac（6′）－Ⅱ、ant（2′′）－I、ant（3′′）－I 7種氨基糖苷類修飾酶基因現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源75株菌株來源于2007年l月至2009年1月我院臨床標本分離所得（不含同一病例相同部位重復分離株），標本的采集、送檢、實驗室接收標本后的處理，按《全國臨床檢驗操作規程》，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603（購自衛生部臨床檢驗中心）。

1.2 儀器與試劑使用法國梅里埃的VITEK-2compact自動化微生物鑒定系統進行菌種鑒定；德國Biometra公司PCR儀；藥敏紙片為英國Oxoid公司產品。

1.3 ESBLs驗證實驗使用雙紙片協同測試法［1］，將含有頭孢噻肟，頭孢他啶，頭孢噻肟／克拉維酸及頭孢他啶／克拉維酸四紙片帖在涂有待測菌的瓊脂培養基上孵育。當加上克拉維酸的紙片比沒加的抑菌環直徑差值≥5mm以上者，即判斷為ESBLs菌株。

1.4 藥物敏感試驗采用Kirby-Bauer紙片擴散法，測定47株大腸埃希菌對5種AGs的敏感性，藥敏結果均按照NCCLS最新標準判定。

1.5 基因檢測均采用PCR法，根據氨基糖苷乙酰轉移酶（AAC）靶基因設計引物，引物序列和目的產物長度見表1［2］。PCR 反應體系（25μl）：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl（含 有：0.1U／μl Taq Ploymerase，500mmol／μl Dntp，20mmol／μl Tris-Cl，100mmol／μl KCL，3mmol／μl MgCl2），上下游引物（10mmol／L）各1μl，DNA 模版5μl，ddH2O 5.5μl。PCR擴增熱循環參數為：95℃預變性3 min，然后95℃30s，55℃60S，72℃60S，循環30周期，最后72℃延長10min。產物經2%瓊脂凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結果，出現與陽性對照分子相等的條帶判為陽性。

表1 氨基糖苷類修飾酶基因PCR引物序列

2 結果

2.1 大腸埃希菌產ESBLs驗證結果臨床分離的75株大腸埃希菌經表型驗證，共檢出產ESBLs菌株47株，陽性檢出率為62.67%。

2.2 藥敏結果47株產ESBLs大腸埃希菌對5種氨基糖苷類抗生素－慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、鏈酶素的耐藥情況分別為80.85%、10.64%、19.15%、51.06%、82.98%。與非產 ESBLs菌株相比，除阿米卡星和奈替米星外耐藥性具有顯著性差異（P＜0.05），詳情見表2。

2.3 基因檢測結果

47株大腸埃希菌中檢出氨基糖苷類修飾酶基因37株（78.72%）。產ESBLs大腸埃希菌中各氨基糖苷類修飾酶陽性檢出率：aac（3）-Ⅱ為51.06%、aac（6′）-I為 38.30%、ant（2″）-I為 25.53%、ant（3″）-I為10.64%、aac（3）-I為4.26%，與非產 ESBLs菌株比較，除aac（3）-I和ant（3″）-I外，其余基因陽性檢出率差異有統計學意義（P＜0.05）。37株攜帶氨基糖苷類修飾酶基因的菌種中，有17株（36.17%）同時攜帶2個基因［以aac（3）-Ⅱ＋aac（6′）-I為主］；且產ESBLs菌株兩基因攜帶率明顯高于非產ESBLs菌株（P＜0.05），詳情見表3。

表2 產ESBIs菌株對AGs耐藥情況比較［n（%）］

表3 產ESBLs菌株與非產ESBI S菌株修飾酶基因陽性率比較［n（%）］

3 討論

大腸埃希菌是臨床各種細菌感染的常見病原菌。目前大腸埃希菌產ESBLs引起的耐藥問題在臨床顯得十分突出，ESBLs通常由質粒所介導。本研究觀察顯示，75株大腸埃希菌ESBLs檢出率為62.67%，表明大腸埃希菌產ESBLs在該地區流行嚴重。氨基糖苷類抗菌藥（AGs）抗菌譜廣、療效卓越，在臨床得到廣泛應用，但氨基糖苷類藥物耐藥問題隨之突出。在本研究中，從臨床分離的47株產ESBI S大腸埃希菌對鏈霉素和慶大酶素的耐藥率最高，達到82.98%和80.85%；其次妥布霉素51.06%，奈替米星19.15%，阿米卡星的耐藥率較低，僅為10.64%。這可能與阿米卡星、奈替米星經過結構改造、對修飾酶具有一定穩定性有關，所以耐藥率遠低于慶大霉素和鏈霉素。大腸埃希菌對氨基糖苷類抗菌藥的耐藥機制主要有以下四個方面：①藥物作用靶位的改變；②細胞壁通透性改變或細胞內轉運異常；③氨基糖苷類修飾酶的產生；④16S rRNA甲基化酶的產生。

氨基糖苷類修飾酶（Aminoglycoside modifying cnzymcs，AMEs）能作用于氨基糖苷類抗生素特定的氨基或羥基，使抗生素發生鈍化，降低或喪失對靶位16sRNA的親和力，使細菌在抗生素存在的情況下具有一定存活能力的酶［3］。按功能可分成乙酰轉移酶（AAC）、磷酸轉移酶（AHP）、核苷轉移酶（ANT）三類［4］。此類基因通過整合子，轉座子、質粒等可移動性遺傳元件，使其在同種或不同種細菌之間傳播，所表現出來的自我保護機制與臨床耐藥機制相同。PCR技術的廣泛應用，使對AMEs基因的檢測變得及其容易。本研究采用PCR對氨基糖苷類修飾酶基因進行了分析，結果顯示aac（3）-Ⅱ為51.06%，檢 出 率 最 高；其 次 為 aac（6′）-I 為38.30%；最低的為aac（6′）-Ⅱ，檢出率為0，且有17株（36.17%）同時攜帶2個基因。該結果說明從我院分離所得的大腸埃希菌產ESBLs對氨基糖苷類藥物具有相當高的耐藥性。

［1］Muriel G，Jean Winoc D，Nelly B，et al.Nationwide study of the prevalence，characterristics and molecular epidemiology of extendd-spectrum-β-lactamase-producing enter obacteriaceae on france［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（2）：786.

［2］吳 蓉，張 隆，戴俊華，等.產ESBLs大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥表型與修飾酶基因研究［J］.現代檢驗醫學雜志，2010，25（3）：31.

［3］吳 蓉，張 隆，戴俊華，等.產ESBLs大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥表型與修飾基因研究［J］.現代檢驗醫學雜志，2010，25（3）：31.

［4］游春芳，黃永茂，張馨琢，等.產ESBLs大腸埃希菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性探討［J］.中華實驗和臨床感染病雜志，2010，4（3）：14.

Study of aminoglycosides resistance of extended spectrumβ-lactamases-producing strains of Escherichia.coli

.ZHANG Shu-qing.［HospitalAffiliatedtoKailuan（Group）LimitedLiabilityCompanyinTangshanCity，Tangshan063000，China］

ObjectiveTo study molecular epidemiology of the resistance to aminoglycosides（AGs）in Escherichia coli which produce extended spectrumβ-lactamases（ESBLs）.MethodsSix kinds of AMEs of 75strains E.coli.were detected by PCR.ResultsIn 75strains of E.coli.，47（62.67%）ESBLs-producing strains were comfirmed.The Positive rate of Five kinds of AMEs were aac（3）-Ⅱ，aac（6′）-I，ant（2′′）-I，ant（3′′）-I，aac（3）-I，from high to low.Resistance to aminoglycosides were streptomycin，gentamicin，tobramycin，netilmicin，amikacin，，from high to low.ConclusionE.coli.resistance to AGs became more serious because of ESBLs producing.Some strains had two or more than two kinds of AMEs gene.

Escherichia coli；drug resistance；AMEs

R378.2＋1

A

1007－4287（2012）02－0299－03

張淑青（1975-），女，本科學歷，唐山市開灤（集團）有限責任公司醫院主管技師，主要研究方向：細菌的耐藥性。

2011－03－10）