乙型肝炎患者HBVDNA及AMA檢測與肝臟纖維化相關性的研究

金建國，馬作新

（1.撫順市中醫院 檢驗科，遼寧 撫順 113008；2.遼寧省人民醫院 檢驗科，遼寧 沈陽 110016）

乙型肝炎患者HBVDNA及AMA檢測與肝臟纖維化相關性的研究

金建國1，馬作新2

（1.撫順市中醫院 檢驗科，遼寧 撫順 113008；2.遼寧省人民醫院 檢驗科，遼寧 沈陽 110016）

目的 探討乙肝病毒DNA（HBV DNA）、抗線粒體抗體（AMA）與肝臟纖維化之間的相關性及臨床應用價值。方法采用聚合酶鏈反應技術檢測HBV DNA；用化學發光法進行層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）及Ⅳ型膠原蛋白（CIV）的檢測；分別采用間接免疫熒光法及免疫印跡法檢測抗線粒體抗體（AMA）及其M2型抗體。結果將每組的肝纖維化指標進行比較發現：HBV DNA濃度大于103copies／ml且小于105copies／ml組（A組）與HBV DNA濃度大于105copies／ml（B組）比較有統計學意義（P＜0.01）；B組與HBV DNA濃度大于105copies／ml且AMA陽性組（D組）比較有統計學意義（P＜0.01）；各組與對照組比較均有統計學意義；此外，A、C組比較無統計學意義（P＜0.05）。結論1.LN、HA、PCⅢ、CIV能夠很好的反映肝纖維化進展狀況，指導臨床治療。2.HBV DNA活躍復制且伴有抗線粒體陽性者較僅HBV DNA陽性者更易發生肝臟纖維化。

HBV DNA；AMA；肝臟纖維化

（ChinJLabDiagn，2012，16：0278）

我國是乙型肝炎高發區，據全國流行病學調查資料，乙肝病毒（HBV）感染率為5%－18%。慢性乙型肝炎10%－20%可發展為肝硬化，1%－5%可演變為肝癌，對人類健康危害極大［1］。慢性乙型肝炎的轉歸受病毒本身因素、宿主免疫因素及治療方案等多種因素綜合影響，肝組織學檢查是診斷肝纖維化等肝病轉歸狀況評價的金標準。但由于此檢查屬有創檢查，患者依從性較差，臨床上難以將肝穿刺活體組織學檢查作為常規檢查手段。肝纖維化血清學指標層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白（CIV）是反應肝纖維化的有效指標，且二者量化關系較好，使醫生在無肝組織學檢查情況下用血清學指標來推斷肝組織的纖維化程度成為可能。此外，據報道，另一種可致肝纖維化的疾病——原發性膽汁性肝硬化（PBC）的發病率約為（2－24）／10萬，年發病率約為（0.4－3）／10萬，而且呈逐年增長的均勢［2］。而在PBC的診斷中，抗線粒體抗體（AMA）是一個很有價值的指標，95%以上的PBC病人可以檢測到AMA，尤其是AMA-M2，但是，在正常人群中也可檢測到低滴度的AMA，而在靶細胞——膽管內皮細胞中靶抗原的表達與mRNA的表達不平行，所以，迄今為止還沒有證據表明AMA是真正的自身抗體或是與細菌、病毒或外源生物相關抗原交叉反應的抗體［3］。在臨床標本中也會經常檢測到低滴度的AMA，尤其在乙肝陽性的一些患者中，為探討HBV DNA、AMA與肝纖維化進展程度是否存在一定的相關性，我們進行了如下的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 256例來自我院2006年至2008年門診及住院患者標本。根據其HBVDNA濃度及AMA熒光表現進行分組：A組為117例1×103copies／ml＜HBVDNA＜1×105copies／ml及AMA陰性乙肝患者；B組為HBV DNA＞1×105copies／ml的83例患者；C組為32例1×103copies／ml＜HBV DNA＜1×105copies／ml且AMA陽性滴度在1∶100與1∶320之間的患者；D組為 HBV DNA＞1×105copies／ml且AMA陽性滴度同樣在1∶100與1∶320之間的24例患者；另設健康對照組為30例健康體檢合格者。

1.1.2 主要儀器 Roche公司生產的lightcycler熒光定量PCR儀；北京源德生物醫學工程有限公司生產的 YDME JETLIA-962型化學發光儀；OLYMPUS的BX50熒光顯微鏡；上海科華公司的KHB ST-360型酶標儀。

1.1.3 主要試劑 深圳匹基公司的熒光定量PCR試劑盒；北京源德公司的肝纖維化四項試劑包括LN、PⅢNP、IVC、HA試劑盒；德國歐蒙公司抗核抗體檢測試劑及AMA-M2的檢測試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 HBVDNA的檢測 按試劑盒說明書操作。

1.2.2 肝纖四項檢測 a IV 型膠原、PIIINP、LN檢測：利用化學發光雙抗體夾心法原理檢測人體血清中IV型膠原、PIIINP、LN的含量。b血清中HA檢測：利用化學發光競爭法原理檢測人體血清中HA的含量。

1.2.3 免疫印跡法檢測AMA-M2 按試劑盒說明書操作。

1.3 統計學方法

2 結果

對不同組別的標本分別進行 HA、PCⅢ、IVC及LN等4項肝纖維化指標的檢測，所測結果見表1。所測四項肝纖指標的正常參考范圍分別為：LN＜130ng／ml、PCⅢ＜120ng／ml、IVC＜120ng／ml、HA＜120ng／ml健康對照組各項指標均在參考范圍內，其余4組均有不同程度的增高。對其進行統計學分析表明：A、B組比較（P＜0.01）差異有統計學意義；B、D組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；各組與對照組比較均有顯著差異（P＜0.01）；此外，A、C組進行比較無統計學意義（P＞0.05）。其中C、D組均存在低滴度的AMA陽性，同樣也對其進行了進一步的免疫印跡檢測，僅個別幾例患者檢出抗線粒體M2型抗體弱陽生，由于樣本例數較少未進行統計學分析，只提示個別病例有進一步發展為原發性膽汁性肝硬化（PBC）的可能。

表1 5組測試者肝纖維化檢測結果

3 討論

肝纖維化是由各種因素引起肝細胞脂肪變、壞死及炎癥后，進而在壞死區發生膠原纖維增生，細胞外基質過度增生和沉積而形成。目前能反映肝纖維化的指標較多，臨床中應用HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C較多。HA是一種蛋白多糖，是構成肝細胞外基質的主要成分之一，可被肝竇內皮細胞攝取、降解，肝細胞受損可影響內皮細胞功能，使血清HA含量升高；LN是主要的基底膜糖蛋白，在肝纖維化發展過程中，LN沉積于Dissee空隙，用于形成完整的內皮細胞基底膜，實驗研究發現［4］，其與肝纖維化形成有重要關系，是門脈高壓發生的主要基礎，血清LN水平常與IV-C、HA相平行；IV-C組成肝內皮細胞與肝細胞之間的功能性基底膜，肝纖維化時基底膜的形成和破壞均增加，致使血清IV-C水平升高。細胞外基質主要以膠原蛋白為基本結構，肝纖維化時膠原細胞增生和活化，Ⅲ型膠原合成增加，導致血清PCⅢ水平升高。

本研究顯示，HBV DNA＞1×105copies／ml組（B組）較之DNA濃度介于103及105cipies／ml的A組，更易于發生肝纖維化（P＜0.01），說明了病毒的活躍復制對肝病的進程有所影響；而另一合并有抗線粒體抗體且HBV DNA大于105cipies／ml的D組與B組比較起來更促進了疾病的發展（P＜0.01）；但同樣是病毒的低復制狀態的 A、C組，AMA的存在就未對肝纖維化程度有所影響，這也說明了低滴度抗線粒體對不同病毒復制狀態的組群影響是不一致的，有待于對大樣本分析。

對于與慢性乙型肝炎殊途同歸即同樣可導致肝纖維化，進一步發展為肝硬化的疾病——PBC，AMA抗體在其診斷中所起的作用也同樣受到研究人員的關注。2000年美國肝病學會PBC診斷指導建議［5］診斷標準為：（1）堿性磷酸酶等反映膽汁瘀積的生化指標升高；（2）B超或膽管造影示膽管正常；（3）抗線粒體抗體或 AMA-M2陽性；（4）若血清AMA或AMA-M2陰性，病理檢查需符合PBC改變。因此從這一標準看來，本文所選病例均非原發性膽汁性肝硬化，至多數年后發展為PBC的可能性要大些，但在促進肝病的發展中卻起到了一定的作用，這可能與其免疫機制相關。抗線粒體抗體存在9種亞型，其中主要的相關抗原有丙酮酸脫氫酶E2亞基（PDC-E2）。2-氧戊二酸脫氫酶復合體（OGDC）、支鏈2-氧酸脫氫酶復合體的E2亞基、亞硫酸鹽氧化酶及糖原磷酸化酶等，所以若存在抗線粒體抗體可對肝臟的氧化磷酸化過程有一定影響，存在著促進肝纖維化的可能。

此外，TNF-α可以誘導 TNF、IL-1及IL-6的產生，增加HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗原表達，促進B、T細胞增殖及免疫球蛋白的合成，具有廣泛的誘導炎癥和免疫調節功能，據報道［6］AMA的存在可使TNF-α在體外生成減少，提示其為病毒大量復制提供了一定的免疫學條件；IL-10由Th2型CD4＋T細胞分泌，是一個重要的抑制因子，能夠調控前炎Th1細胞反應的誘導，因此IL-10在維持自身免疫耐受性中具有重要作用，抗線粒體抗體與Th1細胞有關，IL-10分泌的下降可導致耐受下降、自身反應Th1型CD4＋T細胞異常激活，這也使C組與對照組之間比較存在著顯著性差異（P＜0.01）。

成熟的CD8T淋巴細胞是清除HBV的主要效應細胞，CD8T淋巴細胞刪除可導致持續性HBV感染［7］。由于急性乙型肝炎（AHB）患者 體內存在強烈而多特異的CTL反應，因此能徹底清除體內的HBV，使AHB患者完全康復。相反，在慢性肝炎患者中，抗病毒的免疫反應太弱而不足以控制和清除病毒，相反卻能觸發并維持持續的壞死性炎癥，使細胞內部抗原持續暴露也是產生AMA的一個誘因之一，肝細胞在不斷壞死不斷修復中也促進了纖維化的進程。

據研究［8］，CD4＋CD25＋調節性 T細胞是一群專職的主動抑制針對自身抗原或外來抗原的免疫反應T淋巴細胞。其特點是特異性地表達FoxP3（forkhead／winged helix transcription factor）。在CHB狀態下，Treg影響了針對病原的特異性細胞免疫功能，最終可能影響疾病進程。近期發現，Treg可抑制HBV抗原介導的自體PBMC增殖，反映出可能有HBV抗原特異性Treg的產生，刪除Treg后可增強HBV特異性T淋巴細胞的功能［9］。因此Treg的上調也降低了對AMA的反應，研究表明，Treg細胞在整個HBV感染所導致的免疫反應中發揮了重要作用。隨著HBV感染進程的發展，一方面Treg抑制效應性T細胞的數量和功能，另一方面，不論是外周血Treg頻率，還是肝組織浸潤的Treg細胞絕對數量均逐漸增加，并且與病毒復制向慢性肝炎、肝硬化、肝癌的發展以及患者的生存時間相關［10］。所以從這些因素也可以在一定程度上解釋在病毒活躍復制及AMA陽性病例中肝纖維化指標顯著升高的原由。

1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后，隨著對更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析，發現不同患者感染的HBV DNA序列存在差別，而且不同基因序列的HBV感染機體后產生的抗體應答的性質也存在顯著的差別，因此，根據HBV感染之后抗體應答性質的差別，將HBV分成不同的血清型（serotype）；根據HBV DNA基因序列的不同，將 HBV分成不同的基因型（genotype）。實際上，每一個患者血清中都存在大量拷貝的HBV，每一拷貝的HBV DNA序列不盡相同，表現出準種（quasispecies）的特點［11，12］。準種的概念強調的是遺傳學特點高度相關又有不同，同時在自身和外界因素的影響下優勢和劣勢種群的構成又處于不斷變化之中［13］。在一部分HBV DNA低滴度及高復制的乙肝患者血清中所檢測到的AMA也可能是HBV某一準種的交叉抗體，在HBV DNA低復制狀態中AMA的協同作用有可能未對肝纖維化進程有所影響，所以表現出A、C兩組比較未見統計學意義（P＞0.05）。

肝纖維化及早期肝硬化可逆轉，其中早期肝硬化經治療逆轉率達75%，故早期診斷對延緩肝硬化病程，甚至逆轉起重要作用。研究顯示［14］，HA隨著慢性肝炎病程的進展而逐漸升高，尤其在慢性肝炎重度階段和肝硬化時升高最為顯著，是判斷肝纖維化程度的敏感指標；血清PCⅢ在慢性肝炎加重階段合成最活躍，但在肝硬化階段PCⅢ合成減慢［16］；CⅣ與HA在肝纖維化發展病程中有很好的相關性，能較好地反映肝纖維化早期病變，另外，血清LN對晚期肝纖維化程度及肝硬化的診斷意義較大［14］。本研究也表明，各實驗組，此四項肝纖維化指標與健康對照組比較均有統計學意義（P＜0.01），只是升高的程度有所不同，所以在病程初期就應積極用藥，對D組的情況應動態檢測其對治療的反應程度，以調整用藥的種類及劑量。

抗病毒治療是目前對慢性HBV感染的主要治療措施。當前主要有5種治療藥物：IFN-α2b、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和IFN-α2a（PEGIFN）。這些藥物有利于抑制HBV復制，減輕肝臟損傷和減慢疾病進展。此外抗病毒治療還可部分地糾正HBV特異性T淋巴細胞的低反應性，但不能誘導免疫系統的完全恢復［17］。對于A、B組類的HBV患者，如果及早的進行了抗病毒治療來干預疾病的進程，對控制肝纖維化的發展還應是大有裨益的，對于不多見的B、D組類患者，應如何改進治療方案，也為臨床診治提出了問題。目前，關于乙肝的免疫治療已有大量研究，如體外擴增樹突狀細胞（DC）并經HBsAg負載后自體回輸治療乙肝有一定治療效果，還有通過HBV治療性蛋白疫苗治療乙肝也起到一定療效［18，19］。近年來，免疫重建（immune reconstitution）方法逐漸興起［20］。免疫重建是指機體在較長時期的免疫抑制后，主動或被動受多種因素影響下逐漸解除免疫抑制，免疫功能得到恢復或重建，可以是完全重建，也可以是不完全重建，包括表型和功能重建。

綜上，通過對HBV患者病毒復制狀況、自身免疫情況及肝纖維化指標的聯合監測，綜合評價患者的疾病進程，以有效地選擇相應的抗病毒藥物及免疫干預措施，對控制疾病的發展、改善病患的生活質量等方面是很有價值的。

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The relativity study of HBV DNA、AMA and hepatic fibrosis for patients of hepatitisB

JINJian-guo，MAZuo-xin.（DepartmentofLaboratoryMedicine，TraditionalChineseMedicalHospitalofFushun，Fushun113008，China）

ObjectiveTo study relativity and clinical value about HBV DNA、anti-mitochondrion antibody（AMA）and hepatic fibrosis.MethodsPolymerase chain Reaction techonology is used to detect HBV DNA.Determination of LN，HA，PCⅢ and CIV is tested by chemical luminous assay.Using indirect immune fluorescent assay and immune printing assay examine AMA and its M2subtype antibody respectively.ResultsAfter comparing the results of hepatic fibrosis about every group，the following cases are analysed：the comparison between A group（Its concentration of HBV-DNA is between 1E＋3copies／ml and 1E＋5copies／ml）and B group（Its concencration of HBV-DNA is above 1E＋5copies／ml）has significant difference（P＜0.01），the comparison between B group and D group（Its concentration of HBV DNA is above 1E＋5copies／ml and Its AMA is positive）has significant difference（P＜0.01），and the comparison between each group and healthy group also has significant difference（P＜0.01），in addition ，there is no signifiant difference between group A and B（P＞0.05）.Conclusion1.The determination of LN，HA，PCⅢand CIV could reflect the process of hepatic fibrosis and direct the clinical treatment.2.It is more possible to develop hepatic fibrosis in patients who have active copoying of HBV DNA and AMA positive than that of single HBV DNA positive.

HBV DNA；AMA；hepatic fibrosis

R512.6＋2

A

1007－4287（2012）02－0278－04

2011－01－14）