活動性結核病患者全血干擾素誘導蛋白10測定及免疫狀態的研究

王 瑩，吳雪瓊，于 庭

（1.吉林大學第二醫院，吉林 長春 130041；2.解放軍第309醫院 全軍結核病研究所，北京 100091）

活動性結核病患者全血干擾素誘導蛋白10測定及免疫狀態的研究

王 瑩1，2，吳雪瓊2＊，于 庭1＊

（1.吉林大學第二醫院，吉林 長春 130041；2.解放軍第309醫院 全軍結核病研究所，北京 100091）

目的 研究全血干擾素誘導蛋白10（interferon-inducible protein 10，IP-10）對活動性結核病的輔助診斷價值及活動性結核病患者免疫狀態。方法分別應用植物血凝素、純化的結核分枝桿菌CFP10／ESAT6融合蛋白刺激人全血產生IP-10，用化學發光免疫分析法檢測105例活動性結核病患者、52例非結核肺部疾病患者、29例健康對照者全血中IP-10水平；繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）確定其診斷活動性結核病的臨界值，并評價其診斷效能。結果活動性結核病組非特異性IP-10水平（868±513pg／ml）高于健康對照組（549±365pg／ml，P＜0.05）與非結核呼吸疾病組（738±459pg／ml，但P＞0.05）。活動性結核病患者組結核特異的IP-10的水平為（287.16±236.49pg／ml），顯著高于非結核呼吸疾病組（56.35±20.54pg／ml，P＜0.001）和健康對照組（52.20±28.28pg／ml，P＜0.001）。活動性肺結核組全血中結核特異的IP-10水平（317±258pg／ml）顯著高于活動性肺外結核組（232±167pg／ml，P＜0.05）；活動性結核涂片抗酸桿菌染色陽性組結核特異的IP-10水平（302±283pg／ml）高于活動性結核涂片陰性組（285±218pg／ml，但P＞0.05）；活動性結核PPD皮試陽性組結核特異的IP-10水平（338±222pg／ml）顯著高于活動性結核PPD陰性組（241±105pg／ml，P＜0.05）。結核特異的IP-10診斷結核病的臨界值為89pg／ml，其靈敏度和特異性分別為85.7%和88.9%。結論活動性結核病患者免疫反應增強，全血結核特異的IP-10檢測可能成為活動性結核病輔助診斷指標之一。

結核；γ-干擾素誘導蛋白10；免疫；診斷

（ChinJLabDiagn，2012，16：0240）

結核病是機體被結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的呼吸道傳染病。統計表明2008年全世界新增結核感染者890萬－990萬［1］，近年來肺結核發病人數及死亡人數已居傳染病之首，早期診斷結核病對控制結核疫情至關重要。診斷結核病的金標準是檢出病原體，但是此種方法靈敏度低。因此，需要一種快速、準確的實驗室診斷方法。ESAT6和CFP10是從結核分枝桿菌短期培養濾液中分離出的兩種特異性分泌蛋白，有較強的免疫原性，它們主要存在于結核分枝桿菌復合群中，卡介苗及大多數其它分枝桿菌中則缺乏該蛋白［2］，因此可以用于鑒別結核菌感染者和卡介苗接種者。γ-干擾素釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA）是一種定量檢測全血在結核分枝桿菌特異性抗原ESAT6和CFP10多肽刺激下釋放γ-干擾素（IFN-γ）水平的方法。目前已有被美國FDA批準應用該原理的Quanti FERON-TB試劑盒，用于結核菌潛伏感染者的檢測［3］，但IGRA在免疫低下的患者中檢測的靈敏度較低［4］。近年來有文獻報道IP-10在活動性肺結核患者體內的高水平表達［5］，Ruhwald M 等［6］研究表明活動性肺結核患者血漿中IP-10水平顯著高于IFN-γ，其檢測的靈敏度較高。因此，本研究應用植物血凝素（PHA）、純化的結核分枝桿菌重組CFP10／ESAT6融合蛋白體外刺激全血后，檢測活動性結核病組與非結核呼吸疾病組及健康對照組中IP-10水平，研究其對活動性結核病的輔助診斷價值及活動性結核病患者的免疫狀態。

1 對象和方法

1.1 對象

1.1.1 試劑與儀器 CFP10／ESAT6融合蛋白由解放軍第309醫院全軍結核病研究所克隆、表達、純化，置－80℃保存備用。植物血凝素（PHA）系SIGMA公司產品。細胞培養液為RPMI-1640培養基（Solarbio公司產品）添加10%小牛血清（杭州四季青公司產品）。γ-干擾素誘導蛋白10試劑盒（包括IP-10捕獲抗體、IP-10檢測抗體和鏈親合素-辣根過氧化酶）為美國BD公司產品。化學發光檢測儀為北京科美東雅發展有限公司產品。

1.1.2 對象 （1）105例活動性結核病患者抗凝標本來源于解放軍第309醫院結核科2010年10月至2011年5月期間，根據我國1992年修訂的《結核病的診斷標準和分類》確診為活動性結核病的住院患者，其中肺結核患者73例，肺外結核患者32例（包括結核性胸膜炎患者15例、結核性腦膜炎9例、頸部淋巴結核患者4例、腎結核1例、乳腺結核1例、結核性腹膜炎1例和盆腔結核1例）。其中男性62例，女性43例，年齡14～83歲，平均40±19歲。

（2）52例非結核肺部疾病患者抗凝標本來源于解放軍第309醫院呼吸科同期入院的肺炎和肺氣腫等其他肺部疾病住院患者。其中男性27例，女性25例，年齡1－82歲，平均61±20歲。

（3）29例健康人抗凝標本同期選擇來自解放軍第309醫院2011年碩士研究生志愿者。其中男性19例，女性10例，年齡25－31歲，平均27±2歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗酸桿菌涂片 用接種環挑取標本（包括痰標本、胸腔積液標本、腦脊液標本）0.05－0.1ml，在玻璃片右側三分之二處均勻涂沫成2cm卵圓形膜。抗酸染色，光學顯微鏡鏡檢（目鏡10X，油鏡100X）。抗酸桿菌呈紅色，找到抗酸桿菌3－9條／100視野以上為抗酸桿菌陽性。

1.2.2 PPD皮膚試驗 吸取卡介苗 PPD 0.1ml（5IU），采用曼圖氏法注射于前臂掌側皮內。于注射后72h由解放軍309醫院結核科醫務人員檢查注射部位反應。若硬結橫徑及縱徑的平均數≥5 mm為陽性。

1.2.3 全血特異性抗原刺激培養 采集肝素鈉或枸櫞酸鈉抗凝血2－4ml，在4h內進行檢測。每份標本設置3孔，加入24孔培養板中，分別為陰性對照不加任何刺激物，陽性對照加植物血凝素（PHA）至終濃度20μg／ml，檢測孔加結核特異的CFP10／ESAT6融合蛋白至終濃度20μg／ml，置37℃、5%CO2培養箱22－24h。

1.2.4 IP-10檢測 用包被液1∶250稀釋單克隆抗體，4℃包被過夜。次日用洗滌液PBST（含0.05%Tween20的PBS，pH7.0）洗滌3次，3min／次，加入10%小牛血清37℃封閉1h，洗滌3次，3min／次，用洗滌液稀釋抗原（1∶10稀釋培養上清和IP-10標準品），每孔100μl，37℃孵育2h，洗滌5次，3 min／次。用洗滌液稀釋IP-10檢測抗體及鏈親合素－辣根過氧化酶，37℃孵育1h后，洗滌7次，3 min／次。加入底物，室溫避光反應5分鐘。應用化學發光檢測儀讀取結果，根據IP-10標準曲線計算IP-10含量（pg／ml）。陰性孔系未刺激時IP-10的基礎水平；陽性孔系PHA非特異性刺激后的IP-10水平；受試者全血中結核特異的IP-10水平系檢測孔IP-10含量減去陰性孔IP-10含量。

2 結果

2.1 健康對照組、非結核呼吸疾病組、活動性結核病組全血中IP-10水平186例受試者全血加入結核特異性蛋白刺激后，通過化學發光酶免疫分析法檢測健康對照組、非結核呼吸疾病組、活動性結核病組全血培養上清中IP-10結果見圖1、表1。活動性結核病組外周血淋巴細胞數略高于非結核呼吸疾病組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。三組未刺激孔的IP-10水平差異也無統計學意義（P＞0.05）。活動性結核病組非特異性IP-10水平高于健康對照組（P＜0.05）與非結核呼吸疾病組（P＞0.05），非結核呼吸疾病組高于健康對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。活動性結核病組結核特異的IP-10水平顯著高于非結核呼吸疾病組和健康對照組（P＜0.001），而健康對照組與非結核呼吸疾病組差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 受試者全血培養結核特異的IP-10值分布

2.2 活動性結核病分組中全血IP-10水平結果見表2，活動性肺結核組全血中結核特異的IP-10水平顯著高于活動性肺外結核組（P＜0.05）；活動性結核病分組中涂片抗酸桿菌染色陽性組結核特異的IP-10水平與涂片陰性組差異無統計學意義（P＞0.05）；活動性結核病分組中PPD皮試陽性組結核特異的IP-10水平顯著高于PPD陰性組（P＜0.05）。

2.3 ROC曲線分析及各組IP-10結果判定

以敏感性為縱坐標、1－特異性為橫坐標繪制結核特異的IP-10的ROC曲線（圖3）。應用軟件SPSS17.0計算IP-10的曲線下面積是0.906，標準誤是0.022，95%置信區間（0.863－0.949）。根據ROC曲線得出的IP-10的診斷臨界值（89pg／ml）判定結果，105例活動性結核病組中90例陽性，靈敏度為85.7%；29例健康對照組中2例（6.9%）陽性，52例非結核呼吸疾病組中7例（13.5%）陽性，總的特異性為88.9%。

表2 不同結核病組全血培養上清中IP-10水平

圖3 結核特異的IP-10ROC曲線

3 討論

目前應用IGRA檢測結核感染者已取得較高的靈敏度及特異性，但對機體內的結核桿菌感染是否處于活動性的診斷仍有待解決。IP-10是由IFN-γ所誘導產生的一種趨化因子，它主要由活化的單核巨噬細胞、各種淋巴細胞等產生，并具有強大的招募T淋巴細胞、單核巨噬細胞的作用。IP-10不僅在體外可以誘導外周血單個核細胞（PBMC）表達IFN-γ，同時在體內也可以募集Th1型細胞分泌IFN-γ，刺激炎癥組織局部產生IP-10，從而使IP-10的分泌不斷增強。雖然IFN-γ和IP-10差異的免疫學機制尚未完全闡明，但目前的研究表明IFN-γ可能是由特異性抗原呈遞細胞（APC）與特異性T細胞相互作用產生的；而IP-10是由許多細胞因子 （IL-1、IL-2、IFN-γ、IFN-a、TNF-a）的信號和受體介導的相鄰 T細胞的信號聯合誘導APC產生的。由于IP-10并不完全依賴于IFN-γ的表達，也可由不產生IFN-γ的T細胞亞群誘導產生，因此，IP-10可能成為比IFN-γ更敏感的檢測 T 細胞識別 的工具［7，8］。Frahm M［9］等和Goletti D［10］等研究結果均表明應用結核特異蛋白刺激全血后，以Quanti FERON-TB商品試劑盒作為對照，發現IP-10在鑒別結核感染者和非結核感染的健康人時，比IFN-γ具有更高的敏感性。但關于活動性結核病與非活動性結核呼吸疾病患者IP-10的比較研究國內外尚未見報道。

人體初次感染MTB后，機體特異性T細胞被激活并釋放少量的細胞因子。當受試者全血受到結核特異性的蛋白刺激后，曾被MTB激活的記憶T細胞就會對這些特異性抗原產生反應，發生增殖分化并釋放出大量IP-10。因此，本文的研究結果顯示活動性結核病組結核特異的IP-10水平顯著高于非結核呼吸疾病組和健康對照組，而健康對照組與非結核呼吸疾病組差異無統計學意義。IP-10是由單核巨噬細胞及各種淋巴細胞分泌，全血中淋巴細胞數可能影響其產生水平，本研究結果表明，活動性結核病組外周血淋巴細胞數盡管略高于非結核呼吸疾病組，但無統計學意義，說明IP-10只是由機體內結核特異的、活化的T淋巴細胞分泌表達，而靜止的T淋巴細胞低表達或不表達。活動性肺結核組結核特異性IP-10水平顯著高于活動性肺外結核組，可能是肺外局部的MTB進入血循環量較少，外周血中特異性T淋巴細胞受MTB特異性抗原刺激較少所致。活動性結核病分組中涂片陽性組結核特異的IP-10水平與涂片陰性組差異無統計學意義，表明結核特異性IP-10水平可能與體內的結核菌含量無關。活動性結核病分組中PPD皮試陽性組結核特異的IP-10水平顯著高于PPD陰性組，可能與機體的免疫狀態有關，他們均是已確診的活動性結核病患者，而PPD呈陰性反應可能因為機體細胞免疫功能低下、重度結核或無反應結核，導致結核特異的IP-10分泌減少。由于本文PPD陰性組例數較少（8例），我們將進一步研究兩者之間的關系。本研究通過ROC曲線確定IP-10臨界值為89pg／ml，它輔助診斷活動性結核病具有較高的靈敏度和特異性（分別為83.2%、88.9%），與Frahm M［9］等研究結果一致，其應用IP-10診斷結核感染的靈敏度和特異性分別為84.1%、96.2%。由此可見，IP-10可能成為結核病輔助診斷和鑒別診斷的有用工具。

Ruhward M 等［4］應 用 ESAT-6、CFP-10 和TB7.7蛋白刺激全血后，以Quanti FERON-TB商品試劑盒為對照，發現IP-10檢測結核感染者和非結核感染者的靈敏度和特異性高于IFN-γ，并且對于免疫功能低下或缺陷的人群檢測結核特異性IP-10的水平比IFN-γ更有意義。Ruhward M 等［11］認為應用IP-10代替IFN-γ或者與IFN-γ聯合檢測可能對于結核感染的檢測、結核病輔助診斷和鑒別診斷更具有臨床價值。

本研究活動性結核病組、非結核呼吸疾病組和健康對照組中患者平均年齡差異較大（P＜0.05），可能患者年齡影響全血中IP-10水平。但每份標本均用PHA作為陽性對照孔，它是一種非特異性抗原，可非特異性地激活機體T淋巴細胞分泌細胞因子，已廣泛用于判斷機體的基礎免疫力。本研究活動性結核組非特異性IP-10水平顯著高于健康對照組，略高于非結核呼吸疾病組但無統計學差異；而非結核呼吸疾病組也略高于健康對照組卻無統計學意義，說明患者年齡對全血中IP-10釋放水平并無影響，且患者患病后機體細胞免疫均有所增強，尤其是活動性結核病患者更顯著，這可能與患者體內MTB特異性抗原持續刺激，使特異性T淋巴細胞處于過度免疫反應狀態有關。

Azzurri A等［12］的研究發現活動性結核病組無抗原刺激的全血的IP-10水平顯著高于結核潛伏感染組，認為IP-10可用于活動性結核病和結核潛伏感染的鑒別診斷，但Alessandri AL等［13］的研究結果卻顯示這兩組間并無顯著差異。由于本研究并未在健康對照組和非結核呼吸疾病組中檢測結核潛伏感染者，三組未刺激孔的IP-10水平差異無統計學意義（P＞0.05），因此，無法判斷無抗原刺激的全血中IP-10的水平是否可用于活動性結核和結核潛伏感染的鑒別診斷。

通過對本研究結果分析表明，活動性結核病患者免疫反應增強，結核特異的IP-10水平顯著高于非結核呼吸疾病患者和健康人，全血IP-10檢測可能成為結核病輔助診斷指標之一。今后我們將擴大樣本進一步研究全血IP-10和全血IFN-γ對活動性結核病的輔助診斷價值。

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［12］Azzurri A，Sow OY，Amedei A，et al.IFN-gamma inducible protein 10and pentraxin 3plasma levels are tools for monitoring inflammation and disease activity in Mycobacterium tuberculosis infection［J］.Microbes Infect，2005，7（1）：1.

［13］Alessandri AL，Souza AL，Oliveira SC，et al.Concentrations of CXCL8，CXCL9and sTNFR1in plasma of patients with pulmonary tuberculosis undergoing treatment［J］.Inflamm Res，2006，55（12）：525.

The analysis of IP-10in human blood and the active tuberculosis patients＇immune states

WANGYing1，2，WUXueqiong2，YUTing1.（1.TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China；2.TuberculosisResearch Laboratory，The309thHospitalofPLA，Beijing100091，China）

ObjectiveTo exploit the value of interferon-inducible protein 10 （IP-10）in active tuberculosis＇s auxiliary diagnosis and immune status of the active tuberculosis patients.MethodsThere were 186human whole blood samples，105samples of active tuberculosis patients，52samples of non-tuberculous pulmonary disease patients and 29healthy controls，stimulated by PHA and purified fusion protein CFP10／ESAT6of mycobacterium tuberculosis respectively to produce IP-10.The level of IP-10was evaluated by chemiluminescence enzyme immunoassay.Then the receiver operating characteristic curve was drawn to determine the threshold of IP-10for diagnosis of active tuberculosis and to evaluate its diagnostic performance.ResultsThe non-specific IP-10levels of the active tuberculosis group（868±513pg／ml）was higher than that of the healthy control group（549±365pg／ml，P＜0.05）and that of the non-tuberculous pul-monary disease group（738±459pg／ml，butP＞0.05）.The specific IP-10level of active tuberculosis group（287.16±236.49pg／ml）was significantly higher than that of non-tuberculous pulmonary disease group（56.35±20.54pg／ml，P＜0.001）and that of the healthy control group（52.20±28.28pg／ml，P＜0.001）.The specific IP-10level of active tuberculosis group（317±258pg／ml）was significantly higher than that of the extra-pulmonary tuberculosis group（232±167pg／ml，P＜0.05）.The tuberculosis-specific IP-10level of the active tuberculosis acid-fast bacilli smear-positive group（302±283pg／ml）was higher than that of the active tuberculosis smear-negative group（285±218pg／ml，butP＞0.05）.The specific IP-10level of PPD the active tuberculosis tuberculosis skin test positive group（338±222pg／ml）was significantly higher than that of the active tuberculosis PPD-negative group （241±105pg／ml，P＜0.05）.The threshold of IP-10for diagnosis of tuberculosis was 89pg／ml and its sensitivity and specificity were 85.7%and 88.9%respectively.ConclusionThe immune response strengthens in tuberculosis patient and the whole blood tuberculosis special IP-10examination may become one of the active tuberculosis auxiliary diagnostic targets.

tuberculosis；interferon-inducible protein 10；diagnosis；immunity

R521

A

1007－4287（2012）02－0240－05

國家重大傳染病防治科技重大專項基金資助（2008ZX10003-001）；吉林省科技廳課題（ 200505115；201115079）

＊通訊作者

2011－04－13）