miR-452在腎透明細胞癌中的異常表達研究

盧麗華，吳金斌，余振東，趙春娟，2，翟慶娜，2，周 亮

（1.北京大學深圳醫院 檢驗科，廣東 深圳 518036；2.汕頭大學 醫學院；3.北京大學深圳醫院 男性生殖與遺傳重點實驗室）

miR-452在腎透明細胞癌中的異常表達研究

盧麗華1，吳金斌1，余振東1，趙春娟1，2，翟慶娜1，2，周 亮3＊

（1.北京大學深圳醫院 檢驗科，廣東 深圳 518036；2.汕頭大學 醫學院；3.北京大學深圳醫院 男性生殖與遺傳重點實驗室）

目的 檢測miR-452在腎透明細胞癌組織中的表達差異，探討miR-452在腎癌發生過程中的作用。方法提取20例腎透明細胞癌及其相應癌旁組織的總RNAs，通過逆轉錄（RT）方法獲得cDNA后，采用實時定量PCR（RT-qPCR）技術檢測組織中miR-452的表達差異，并分析其與腎癌患者臨床病理特征的關系。結果與相應的癌旁組織相比，miR-452在腎透明細胞癌組織中顯著高表達，癌組織較癌旁組織升高約4.69倍，但其異常表達與腎癌患者臨床病理特征并無顯著相關性。結論miR-452在腎透明細胞癌組織中明顯高表達，其可能作為重要的致癌基因參與了腎癌的發生與發展過程，可能成為潛在的腎癌標志物，為腎癌的早期診斷及治療提供新靶點。

miR-452；腎透明細胞癌；病理特征

（ChinJLabDiagn，2012，16：0237）

microRNAs（miRNAs）是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，通過與靶基因mRNA3’UTR互補結合來調控基因表達。已有研究表明，約50%miRNA定位于基因組上與腫瘤相關的脆性位點［1］。大量的研究證實，異常表達的miRNA在腫瘤的發生發展過程中起到非常關鍵的作用。Zhou等通過第二代基因測序技術對10例腎透明細胞癌組織進行miRNA的表達譜檢測，發現miR-452在腎透明細胞癌組織中表達差異顯著，癌組織較癌旁組織表達明顯上調［2］。但是目前沒有進一步的實驗驗證這一測序結果，其他關于miR-452的研究報道也寥寥無幾。本實驗主要采用RT-qPCR技術檢測腎透明細胞癌及其相應癌旁組織中miR-452的表達水平，分析其異常表達與腎癌患者臨床病理特征的相關性，探討miR-452在腎癌發展過程中的作用，可能為臨床上腎癌的診斷及治療提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源20例腎透明細胞癌及其相應癌旁組織標本主要來自廣東各大醫院行手術治療的腎癌患者。患者術前均未作化療、放射治療或免疫治療等抗腫瘤療法。所有患者均簽署知情同意書，并獲得所在醫院倫理委員會批準。應用國際抗癌組織（UTCC）／美國癌癥聯合會（AJCC）臨床分期標準對腎癌患者進行臨床病理分期。所得標本保存于RNAlater中并置于液氮或－80℃低溫冰箱。

1.2 主要試劑及儀器miRNA逆轉錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit）及熒光定量PCR試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均購自Qiagen公司（德國），特異性miR-452引物由Invitrogen公司（美國）合成，上游序列為：5’-AACTGTTTGCAGAGGAAACTGA-3’；其下游引物為miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒提供的通用引物（詳見試劑盒說明書）。內參基因U6由上海生工生物技術公司（中國）合成，上游序列為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下 游 序 列 為：5’-ACGCTTCACCGAATTTGVGT-3’。實驗中用到的主 要 儀器：普 通 PCR 儀 （Bio-RAD）、qPCR 儀（ABI7000）、電泳儀（Bio-RAD）、臺式高速冷凍離心機（BECKMAN COULTER）、離心機（eppendorf）、－80℃超低溫冰箱及普通冰箱。

1.3 組織總RNA提取應用Trizol試劑在液氮中研磨腎癌及癌旁組織提取總RNA。主要抽提步驟如下：1）取－80℃凍存腎癌及其相應的癌旁組織各50mg，在液氮中研磨；2）加入1ml Trizol試劑（Invitrogen，美國），繼續研磨成粉末狀提取RNA；3）用氯仿、100%異丙醇、75%乙醇分離并洗滌RNA沉淀；4）用30μl無RNase H2O溶解RNA，－70℃保存備用。

1.4 RT-qPCR瓊脂糖凝膠電泳和紫外光分光光度儀測定RNA濃度及質量后，用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒（Qiagen，德國）進行miRNA逆轉錄。按照試劑盒說明書依次加入模板RNA和反應試劑，1μg RNA＋4μl Buffer RT＋1 μl Mix＋適量H2O。反應體系為20μl。反應條件為37℃、1h，95℃、5min。qPCR 應用 miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，德國），反應按照試劑盒說明書進行：1）1μl cDNA＋0.4μl miR-452引物＋10μl Mix＋2μl UP＋6.6μl H2O；2）1μl cDNA＋0.4μl U6F＋0.4μl U6R＋10μl Mix＋8.2μl H2O。反應體系均為20μl。反應條件為：95℃、15min，94℃、30s，55℃、15s，70℃、30s，設置2個重復孔，40個循環結束。

1.5 RT-qPCR結果判定本實驗設實驗組和對照組兩組。腎癌組織miRNA表達量作為實驗組（c）；相應癌旁組織miRNA表達量為對照組（n）。miR-452作為兩組的目的基因，U6作為內參進行標準化處理。CT值表示反應熒光強度到達閾值時所經過的擴增循環次數。△CTc＝CTc目－CTc內，△CTn＝CTn目－CTn內。目的基因的相對表達量（Re）采用△△CT的方法進行分析，△△CT＝△CTc－△CTn，RE＝2－△△CT［3］。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳及結果判定將qPCR擴增產物各取5μl，與Loading Buffer混合均勻后點樣至約2%瓊脂糖凝膠孔隙中。設電泳電壓110V，時間30min。電泳結果若均顯示單條亮帶，說明qPCR擴增產物cDNA具有特異性。若癌標本較對照標本條帶亮，說明目的基因上調；反之較暗則為下調。

1.7 統計學分析應用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行分析。對腎癌及其相應癌旁組織的實驗數據做配對樣本的雙側t檢驗分析，對異常表達的miR-452與腎癌患者臨床病理特征的相關性分析進行卡方檢驗。認為P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA抽提與質控RNA提取完成后進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外照膠儀下顯像示28 s、18s、5s三條清晰條帶；紫外光分光光度儀檢測RNA濃度均大于400ng／μl，OD值于1.8－2.1之間。說明提取的RNA濃度及質量良好。

2.2 RT-qPCR結果通過 RT-qPCR 技術檢測上述腎癌組織標本中miR-452的表達差異。應用公式2－△△CT計算腎癌中 miR-452的相對表達量，對Re＝2－△△CT取對數［log2（Re）］后可得出－△△CT值，表示癌組織與癌旁組織中miR-452的相對表達差異，圖1（數據符合正態分布）。由△CT＝CT目－CT內可分別得到癌與對照組的△CT值，數據符合正態分布。運用SPSS13.0進行統計分析，結果發現，miR-452在腎癌組織中顯著高表達，平均上調倍數為4.69。其中，20例配對標本中，miR-452上調率為85%（17例）。上述統計結果均有統計學意義（P＝0.00＜0.05）。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳結果電泳結果顯示，癌組織標本的條帶明顯比癌旁組織標本亮，說明miR-452在腎癌組織中顯著上調。電泳結果與RT-qPCR數據分析結果一致，說明RT-qPCR結果可靠（圖2）。

2.4 異常表達的miR-452與腎癌患者病理特征的關系將腎癌患者的臨床資料根據病理特征（性別、年齡、TNM分期）進行分組。按性別分為男性組和女性組；按中位年齡47歲分為＜47歲組和≥47歲組；按TNM分期分為T1N0M0和T2N0M0組；以miR-452在腎癌組織中相對表達差異－△△CT的平均值2.04為界，將20例病例標本分為miR-452高表達組和低表達組。

運用SPSS13.0進行卡方檢驗分析miR-452表達與腎癌患者各臨床病理特征之間的關系。結果表明腎癌組織中異常表達的miR-452與患者的臨床病理特征并無明顯相關性。

圖1 20例腎透明細胞癌組織中miR-452的相對表達差異（－△△CT值）

圖2 腎透明細胞癌與癌旁組織中miR-452RT-qPCR產物電泳圖

3 討論

泌尿系統腫瘤中，腎癌是僅次于膀胱癌發生的第二大惡性腫瘤，早期不易發現，治愈率及預后生存率均較低，而且發病率以每年約2.5%的速度增長［4］。目前針對腎癌，主要的治療方法有放射療法、化學治療及免疫療法，但是這些療法都會引起嚴重的副作用。因此，找到新穎的診斷及治療腎癌的靶點，已經成為臨床研究人員追尋的確切目標。

第二代基因測序的發展為腫瘤miRNA表達譜的檢測提供了技術平臺。Weng等通過微陣列、RTPCR及第二代基因測序等技術方法對冰凍和福爾馬林固定的腎癌組織進行了miRNA表達譜的檢測［5］。Zhou等應用第二代大規模平行測序技術進一步證實了腎透明細胞癌組織miRNA的表達譜，發現，與相應的癌旁組織相比，miR-452在腎透明細胞癌癌組織中表達明顯上調［2］。本次實驗主要應用RT-qPCR技術著重對miR-452在20例腎透明細胞癌及其相應癌旁組織中的表達進行驗證。將得到的實驗數據進行統計學處理后，結果顯示，miR-452在癌組織中存在過表達情況，盡管統計結果表明腎癌組織中miR-452的異常表達與患者的臨床病理特征并無顯著相關性，但是可以肯定的是異常高表達的miR-452與腎癌的發生和發展密切相關，極有可能作為一種重要的致癌基因參與了腎癌的發生與發展過程。并且，與相應的癌旁組織相比，miR-452在癌組織中顯著高表達，平均相差5倍左右，因而miR-452可能成為潛在的腎癌特異性標志物，提高腎癌的早期診斷率。

Neil等通過研究表明在神經嵴細胞中有大量的miR-452，充足的miR-452的存在可以糾正Dlx2的適當表達。另外，miR-452還可以調節咽弓上皮－間葉細胞之間的信號傳導，包括 Wnt5a、Shh和FGf8在Dlx2的表達［6］。SOX2是一種維持胚胎和成人干細胞多能性的關鍵基因，Fang等應用第二代測序技術發現敲除SOX2基因可引起一系列的microRNA的表達發生改變，SOX2可調控miR-452的表達下降［7］。本實驗應用RT-qPCR技術檢測到miR-452在腎透明細胞癌組織中顯著上調，可推測miR-452在腎癌的發生發展過程中可能起到了致癌基因的作用。但是，目前關于miR-452在腎癌發生發展過程中的作用機制尚未明確，相關的文獻較少，仍處于探索階段，尚待深入研究。本文通過對miR-452在腎透明細胞癌中的異常表達研究，以期為臨床上腎癌的診斷及治療提供一定的實驗依據。

［1］Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：2999.

［2］Liang Zhou，Jiahao Chen，Zhizhong Li，et al.Integrated Profiling of MicroRNAs and mRNAs：MicroRNAs Located on Xq27.3Associate with Clear Cell Renal Cell Carcinoma［J］.Org，2010，5（12）：1.

［3］Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method［J］.Nat.Protoc，2008，3（6）：1101.

［4］張 騫，金 杰，陶 謙.抑癌基因甲基化在腎細胞癌研究中的新進展［J］.癌癥，2007，26（11）：1276.

［5］Lihong Weng，Xiwei Wu，Hanlin Gao，et al.MicroRNA profiling of clear cell renal cell carcinoma by whole-genome small RNA deep sequencing of paired frozen and formalin-fixed，paraffin-embedded tissue specimens［J］.Journal of Pathology，2010，222：41.

［6］Neil T.Sheehy，Kimberly R.Cordes，Mark P.White，et al.The neural crest-enriched microRNA miR-452regulates epithelialmesenchymal signaling in the first pharyngeal arch［J］.Development，2010，137：4307.

［7］Xuefeng Fang，Jae-Geun Yoon，Lisha Li，et al.The SOX2response program in glioblastoma multiforme：an integrated ChIpseq，expression microarray，and microRNA analysis［J］.BMC Genomics，2011，12：11.

Research on Abnormal Expression of miR-452in Clear Cell Renal Cell Carcinoma

LULi-hua，WUJin-bin，YUZhendong，etal.（ClinicalLabratoryofPekingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036，China）

ObjectiveTo investigate the differential expression level of miR-452in tissue samples of clear cell renal cell carcinoma.Furthermore，we attempt to explore the biological effects of miR-452in the process of renal cell carcinoma.MethodsThe total RNAs were isolated from human clear cell renal cell carcinoma and matched adjacent normal tissues of 20patients with clear cell renal cell carcinoma.RT was performed firstly to get the cDNAs，then qPCR was used to detect the expression level of miR-452in samples above and then the relationship was analysed between the altered miR-452and the clinical pathologic characteristics of patients with clear cell renal cell carcinoma.ResultsCompared with the matched adjacent tissues，miR-452was significantly high expression in clear cell renal cell carcinoma tissues.MiR-452was up-regulated 4.69folds on average than adjacent tissues.However，the expression level of miR-452 had no correlation with the clinical pathologic characteristics of patients with renal cell carcinoma.ConclusionMiR-452 was significantly high expression in tissues of clear cell renal cell carcinoma.This suggested miR-452might be as a key oncogene closely related with the occurrence and development of renal cell carcinoma and maybe served as a potential tumor marker of renal cell carcinoma，and provided a novel target for the early diagnosis and therapy of renal cell carcinoma.

MiR-452；Clear cell renal cell carcinoma；Pathologic characteristic

R737.11

A

1007－4287（2012）02－0237－04

國家自然科學基金（30900817）、深圳市科技計劃項目（201102006）、深港創新圈計劃（ZYB200907080110A）、廣東省科技計劃項目（2011B031800381）

＊通訊作者

2010－10－21）