GRIM-19及其截斷體原核表達載體的構建及表達與純化

王青元，朱 靖，周 穎，許乾乾，朱圓圓，凌 斌

（安徽醫科大學附屬省立醫院 婦產科分子實驗室，安徽 合肥 230001）

GRIM-19及其截斷體原核表達載體的構建及表達與純化

王青元，朱 靖，周 穎，許乾乾，朱圓圓，凌 斌＊

（安徽醫科大學附屬省立醫院 婦產科分子實驗室，安徽 合肥 230001）

目的 構建GRIM-19及其截斷體原核表達載體，在大腸桿菌中誘導表達并純化融合蛋白。方法用RTPCR法從HeLa細胞中擴增出帶BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點的GRIM-19及其截斷體基因片段，將GRIM-19及其截斷體基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表達載體上，在大腸桿菌中誘導表達GST-GRIM-19及其截斷體融合蛋白，用Glutathione Sepharose 4B純化，純化后蛋白經 Western-blot鑒定。結果pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體原核表達載體構建正確，并在大腸桿菌中成功誘導表達，IPTG誘導以濃度0.5mM，時間2h為宜，且通過Glutathione Sepharose 4B成功純化到融合蛋白。結論成功構建GRIM-19及其截斷體原核表達載體，誘導表達并純化GST-GRIM-19及其截斷體融合蛋白。

GRIM-19；誘導表達；純化

（ChinJLabDiagn，2012，16：0191）

GRIM-19（gene associated with retinoid-interferon mortality-19，GRIM-19），是 GRIMs家族的重要成員［1］，是2000年 Angell等［2］發現的由IFN 聯合RA誘導表達的一種新的細胞凋亡調節因子，定位于19p13.2，該區的多種基因為前列腺癌的抑制基因。參與細胞增殖和凋亡的調控過程，其表達降低或位點突變可以導致細胞的異常增殖和惡性轉化，GRIM-19在多種正常組織中表達，參與IFN／RA誘導的腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的發生［3］。本實驗我們利用基因克隆技術構建了GRIM-19及其截斷體原核表達載體，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導pGEX-4T-3載體質粒啟動子，成功誘導了GST-GRIM-19及其截斷體的融合蛋白的表達，為今后研究GRIM-19的分子生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

逆轉錄試劑盒、總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，DEPC購自Sigma公司，TaqDNA聚合酶購自TakaRa公司，小劑量質粒提取試劑盒購自Axygen公司，限制性內切酶BamHⅠ，XhoⅠ及DNA連接酶均購自TaKaRa公司，IPTG購自天根公司，GST純化試劑盒Glutathione Sepharose 4B購自GE公司，GST單抗購自GE公司，Westernblot化學發光底物購自PIERCE公司，BL21、pGEX-4T-3載體質粒感受態細菌由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T-3轉化至大腸桿菌 參考分子克隆第3版中感受態細胞制備和質粒轉化方法和步驟等［4］，制備氨芐抗性的LB平板、BL21感受態細菌以及將pGEX-4T-3載體質粒轉入BL21感受態細菌，經分離鑒定，得到含pGEX-4T-3的對照菌。

1.2.2 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體引物設計 參考GenBank中GRIM-19堿基序列，通過Primer Premier 5.0軟件進行分析后設計出GRIM-19及其截斷體上下游引物（見表1），分別在GRIM-19的第35位氨基酸和第70位氨基酸位點截斷（如表1），引物分別加入了BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點（斜體字部分）。

表1 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體引物設計

1.2.3 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體原核表達載體的構建及鑒定 用trizol法提取HeLa細胞中總RNA，以Oligod（T）18為逆轉錄引物，以提取的總RNA為模板，在M-mlv反轉錄酶催化下反轉錄出cDNA，用上述特異性引物，采用TaKaRa Prime-STAR HS DNA聚合酶進行PCR，擴增目的基因。反應條件：98℃5min 1個循環，98℃10s66℃5s，72℃30s共35個循環，72℃10min 1個循環。各取100μl PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳。依據TaKaRa膠回收純化試劑盒操作規程，膠回收純化目的片段，將GRIM-19及其截斷體編碼區片段與載體pGEX-4T-3分別用BamHⅠ、XhoⅠ酶切，膠回收獲得酶切后pGEX-4T-3載體片段和GRIM-19及其截斷體編碼區片段，然后用TaKaRa T4DNA連接酶，16℃連接過夜，將連接產物轉化入BL21感受態大腸桿菌，涂板（氨芐抗性），過夜生長。各挑取10個單克隆菌落于1ml氨芐抗性LB中生長4－6 h，無菌條件下取微量菌液做菌液PCR初篩，陽性者繼續搖晃生長過夜。參照Axygen質粒小量提取試劑盒操作規程提取純化pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體質粒，BamHⅠ、XhoⅠ酶切質粒，瓊脂凝膠電泳鑒定為陽性者，送到上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.4 融合蛋白的誘導表達 對照菌和重組菌分別涂板（氨芐抗性），37℃生長12h，各挑取1個菌落接種于1ml氨芐抗性的LB培養基，37℃培養過夜，培養物按1∶10接種于氨芐抗性的LB培養基，37℃培養至OD600＝0.5－1；吸出1ml培養物放入1.5ml EP管中，－20℃保存并記錄各自OD600值，其余的培養物中加入IPTG（終濃度0.5mM），30℃震蕩培養2h，取1ml樣品放入1.5ml EP管中，分別測OD600值，室溫12 000rpm離心1min，沉淀重懸于40μl的2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮3min，室溫12 000rpm離心1min，上清按0.15OD量上樣于15%的SDS-PAGE膠，考馬斯亮藍染色，觀察表達產物條帶。

1.2.5 融合蛋白的純化 將誘導表達后的對照菌和重組菌分別用1×PBS重懸后，加入終濃度為1mM的Cocktail，1 280Kpa高壓勻漿法破碎。4℃，12 000rpm離心30min，按照Glutathione Sepharose 4B純化試劑盒說明書，上清加入Glutathione Sepharose 4B，4℃搖晃孵育2h。4℃，500g離心5min，沉淀用pH8.0的GSH Elution buffer洗脫，蛋白上清定量備用。

2 結果

2.1 GRIM-19及其截斷體編碼區片段的PCR產物電泳結果

DNA marker為DL2000DNA標準參照物，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳顯示在432bp、105bp、105bp、222bp位置出現的特異性目的片段，與所設計的GRIM-19及其截斷體編碼區片段大小一致（圖1）。

圖1 GRIM-19及其截斷體編碼區片段的PCR產物電泳結果

2.2 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體重組質粒酶切鑒定、測序

經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后出現分子量分別為4 900bp和432bp、105bp、105bp、222bp的特異性條帶，正好與線性質粒pGEX-4T-3和GRIM-19及其截斷體編碼區片段的分子量一致（圖2）。將pGEX-4T-3-GRIM-19及其截斷體重組質粒送到上海生工生物工程有限公司測序鑒定，測序結果均與目的序列完全相同，表明構建載體成功。

圖2 重組質粒酶切鑒定圖

2.3 融合蛋白誘導表達

對照菌和重組菌經0.5mM IPTG，30℃，誘導2h后，變性上樣于15%的SDS-PAGE膠，考馬斯亮藍染色發現對照菌在26KD處出現很強條帶，各重組菌分別在43KD、30KD、30KD、33KD處可見較強條帶（圖3），表明誘導表達成功。

圖3 考馬斯亮藍染色檢測目的蛋白誘導表達

2.4 融合蛋白純化后的western-blot檢測

將純化好的GST及GST-GRIM-19及其截斷體融合蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，再電轉到PVDF膜上，經封閉后室溫孵育一抗GST（1∶4 000）2h，TBS-T洗后加入相應的二抗孵育2h，膜經TBS-T洗后與ECL發光檢測劑結合，經X片壓片曝光，顯示結果（圖4）。

圖4 Western-blot檢測目的蛋白的表達

3 討論

GRIM-19是新發現的參與細胞線粒體呼吸作用和細胞凋亡調控的新基因，主要表達在線粒體中，細胞核中微量表達［5］。GRIM-19蛋白由144個氨基酸組成，分子量約16KD，是線粒體中NADH脫氫酶復合體的基本亞單位，在Ⅰ型呼吸過程中發揮著重要作用［6］。研究發現，GRIM-19在甲狀腺腫瘤、腎癌、口腔癌以及結直腸癌等腫瘤中表達降低［7］。本實驗組前期研究發現在子宮頸鱗癌和卵巢癌中，GRIM-19的表達降低且與癌基因STAT3的表達呈負相關［8］。Lufei等［9］發現IFN／RA誘導腫瘤細胞凋亡的過程中上調了細胞中GRIM-19的表達。抑制GRIM-19的表達，IFN／RA誘導腫瘤細胞凋亡的作用減弱。反之，增加GRIM-19的表達則顯著增加細胞的凋亡。本實驗中，我們將GRIM-19基因分成三段。Kalvakolanu等［10］發現 GRIM-19①與抗腫瘤功能密切相關。Lufei等［9］發現GRIM-19②能夠與STAT3結合發揮調節細胞增殖和凋亡的作用，從而拮抗STAT3激活所致的細胞永生化改變。GRIM-19③的功能目前不清楚。

大腸桿菌體外表達系統由于其遺傳學、生物化學和分子生物學方面已充分被人們了解而成為許多異源蛋白質的首選表達系統。谷胱甘肽S-轉移酶（GST）基因融合系統廣泛地應用于分子免疫學和分子生物學的研究以及疫苗的生產。天然GST蛋白相對分子質量為26KD，pGEX系列質粒是目前較為常用的GST融合表達系統載體。本文選擇的pGEX-4T-3大小為4.9KD，該載體含tac啟動子和lacIq基因。未誘導條件下lacIq基因產物能結合在tac上，阻止tac啟動子；IPTG誘導后，lacIq基因產物即從tac上釋放出來，tac啟動子被誘導啟動表達，tac啟動子后面的GST標簽和外源性蛋白就能夠表達出來［11］。同時該載體表達的外源蛋白可以通過Glutathione Sepharose 4B純化得到特異性蛋白。

在誘導融合蛋白表達及純化的過程中，IPTG的濃度、作用時間、誘導溫度及裂菌的方式對融合蛋白的表達和純化影響很大，因此，必須通過反復的實驗來探索最佳IPTG濃度、作用時間和誘導溫度等。本實驗在前期摸索試驗的基礎上采用0.5mM IPTG，30℃，誘導2h等最佳誘導條件，既防止大量IPTG產生的細胞毒性作用、高溫條件下蛋白容易出現錯誤折疊和形成包涵體又能滿足外源蛋白大量表達的要求。

本實驗中，我們成功構建了GRIM-19及其截斷體的原核表達載體，在大腸桿菌中通過IPTG成功誘導GRIM-19及其截斷體融合蛋白表達并使用Glutathione Sepharose 4B試劑盒法得到純化蛋白。下一步，我們將借助溶血酶去掉GST標簽得到裸的GRIM-19蛋白或者直接使用融合蛋白進行GRIM-19的體外生物學功能研究。

［1］Kalvakolanu DV.The GRIMs：a new interface between cell death regulation and interferon／retinoid induced growth suppression［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2004，15（2-3）：169.

［2］Angell JE，Lindner DJ，Shapiro PS，et al.Identification of GRIM-19，a novel cell death-regulatory gene induced by the interferonbeta and retinoic acid combination，using agenetic approach［J］.J Biol Chem，2000，275（43）：33416.

［3］Chdambaram NV，Angell JE，Ling W，et al.Chromosomal localization of human GRIM-19，a novel IFN-beta and retinoic acid-ac-tivated regulator of cell death［J］.J Interferon Cytokine Res，2000，20（7）：661.

［4］J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，主編，黃培堂，譯.分子克隆實驗指南［M］.北京：科學出版社，2002：1217－31.

［5］Huang G，Lu H，Hao A，et al.GRIM-19，a cell death regulatory protein，is essential for assembly and function of mitochondrial complex I［J］.Mol Cell Bio，2004，24（19）：8447.

［6］Huang G，Chen Y，Lu H，et al.Coupling mitochondrial respiratory chain to cell death：an essential role of mitochondrial complex I in the interferon-beta and retinoic acid-induced cancer cell death［J］.Cell Death Differ，2007，14（2）：327.

［7］周 穎，凌 斌.GRIM-19的功能及與腫瘤的相關性［J］.醫學分子生物學雜志，2008，5：262.

［8］朱 靖，衛 瑩，王青元，等.GRIM-19基因的表達及沉默對子宮頸癌細胞株SiHa細胞中核轉錄因子STAT3表達的影響［J］.現代婦產科進展，2010，19（4）：245.

［9］Lufei C，Ma J，Huang G，et al.GRIM-19，a death-regulatory gene product，suppresses Stat3activity via functional interaction［J］.EMBO J，2003，22（6）：1325.

［10］Kalvakolanu DV，Nallar SC，Kalakonda S.Cytokine-induced tumor suppressors：A GRIM story［J］.Cytokine.2010，52（1-2）：128.

［11］Winograd E，Pulido MA，Wasserman M.Production of DNA-recombinant polypeptides by tac-inducible vectors using micromolar concentrations of IPTG［J］.Biotechniques，1993，14（6）：886.

Construction of GRIM-19and Its Truncated body prokaryotic expression vector and fusion protein induced expression and purification

WANGQing－yuan，ZHUJing，ZHOUYing，etal.（MolecularlaboratoryDepartmentofObstetricsand Gynecology，AnhuiProvincialHospitalaffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity，Hefei230001，China）

ObjectiveTo construct the GRIM19and its truncated body prokaryotic expression vector，express the Fusion protein in E.coli and purify the expressed product.MethodsGRIM-19Its Truncated body gene sequence with BamHⅠand XhoⅠ，restriction enzyme cutting site were amplified from total RNA of HeLa cell line by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），then the GRIM-19its truncated body gene sequence was inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3，induced express the fusion protein in E.coli and purified by Glutathione Sepharose 4B，Western-blot were used to test the fusion protein.ResultsThe pGEX-4T-3-GRIM-19its truncated body prokaryotic expression vector was constructed correctly and the fusion protein was correctly inducted expression，the optimal concentration and time of IPTG for induction was 0.5mM and 2h，and the fusion protein was successfully purified.ConclusionThe pGEX-4T-3-GRIM-19and its truncated body prokaryotic expression vector was successfully constructed，Inducible expression and purification of GST-GRIM-19and its truncated body fusion protein.

GRIM-19；inducible expression；purification

R730.231

A

1007－4287（2012）02－0191－04

國家自然科學基金資助（81072127、81001168）

＊通訊作者

2011－08－16）