一起蛋雞大腸桿菌病的病原分離鑒定與防治

王傳禹，常志順，楊 斌，楊向東

(1.云南省畜牧獸醫科學院，云南 昆明 650224;2.昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司，云南 昆明 650215)

雞大腸桿菌病是由某些致病血清型或條件性致病大腸桿菌引起的不同疾病的總稱，在集約化雞場已成為危害雞群的主要疾病之一。臨床上表現為敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、全眼球炎、腦炎等，發病率高，死亡率高，且因與其它呼吸道疾病(如慢性呼吸道疾病)混合或繼發感染而使死亡率升高。在產蛋母雞，可發生腹腔內的大腸桿菌感染，發展成為卵黃性腹膜炎。

2011年7月，昆明某蛋雞場羅曼褐育成雞4 500只，產蛋雞4 200只，相繼發生以下痢、呼吸困難、眼球炎和產蛋率下降為特征的疾病。育成雞從60日齡開始陸續發病，病雞精神萎頓，多數出現呼吸困難，有啰音，腹瀉，糞便呈灰綠色，腳軟，站立不穩，部分眼瞼腫脹，角膜混濁，最后失明，3～7 d死亡，病死率約為9%;產蛋雞從210日齡開始陸續發病，產蛋率迅速下降5%，病雞多精神沉郁，食欲減退，腹部膨大，糞便灰綠色或黃色，多經1～2周死亡，病死率約為3%。病死雞剖檢病理變化表現為典型的氣囊炎、肝周炎、心包炎，卵巢變形、卵泡破裂，腹腔內充滿卵黃液并引起腹膜炎致使腸粘連，卵黃凝固，氣味惡臭。無菌采取病死雞肝臟等樣品，進行實驗室檢查，確定雞群為大腸桿菌感染。通過藥敏試驗篩選出敏感藥物和利用大腸桿菌分離株制備自家滅活菌苗用于雞群的治療和預防，收到滿意的效果，現將實驗結果與防治情況報告如下。

1 細菌分離與鑒定

1.1 材料

1.1.1 病料

具有大腸桿菌病癥狀的病死雞和瀕死雞，剖檢采集肝臟組織及卵巢或卵黃、眼球液等組織作為細菌分離的材料。

1.1.2 培養基與試劑

鮮血瓊脂培養基、普通營養瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、營養肉湯，細菌微量生化反應管和藥敏紙片為杭州天和生物試劑有限公司生產。

1.1.3 試驗動物

購自昆明某雞場。

1.1.4 血清

禽大腸桿菌標準O因子血清，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養

無菌操作取病死雞的肝臟、眼球液、卵黃等，劃線接種鮮血瓊脂平板，置37℃培養箱中培養18～24 h。選擇單個菌落接種普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板，符合大腸桿菌的生長特性時，在營養肉湯中增菌培養，37℃培養18 h。

1.2.2 生化試驗

取麥康凱瓊脂上磚紅色單個菌落接種細菌生化微量鑒定管，置37℃培養箱中培養24 h，觀察并記錄結果。

1.2.3 藥敏試驗

將分離的菌株，按常規紙片法進行藥敏試驗，根據抑菌圈直徑大小判定其敏感性。

1.2.4 血清學試驗

經形態學、培養特性檢查和生化試驗鑒定為大腸桿菌的，血清型鑒定按中國獸醫藥品監察所提供的產品使用說明書進行操作。

1.2.5 致病性試驗

將分離菌接種營養肉湯，37℃培養18 h，采用比濁法測定細菌含量，調整菌數為1.0×108CFU/mL，皮下接種10日齡雛雞3只，每只0.5mL;并設對照組3只，皮下注射0.5mL無菌營養肉湯。接種后觀察72 h，記錄死亡情況，并取肝脾進行細菌分離。對72 h后存活者剖殺，觀察病變并做細菌分離。

1.3 結果

1.3.1 分離培養結果

先后共分離獲得14株符合大腸埃希氏菌特征的雞源大腸桿菌，病原菌在鮮血瓊脂平板上形成圓形隆起、濕潤的大菌落;在普通瓊脂平板上菌落為灰白色;在麥康凱瓊脂上形成磚紅色濕潤的菌落;在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色，具有金屬光澤的菌落;在普通肉湯中均勻混濁，管底有少量灰白色沉淀，有糞臭味。用革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陰性的小桿菌。分離株用15%甘油血清－70℃保存。

1.3.2 生化試驗結果

14株細菌能100%分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，不能分解肌醇，靛基質、MR、硝酸鹽試驗呈陽性，H2S、V－P、檸檬酸鹽試驗呈陰性。

1.3.3 血清型鑒定結果

符合大腸桿菌特性的14株細菌純培養物與大腸桿菌O因子血清做凝集試驗，鑒定出3種血清型，其中O78有4株、O161有2株、O4有1株，4株自凝、3株有待于進一步的血清型鑒定。

1.3.4 致病性試驗結果

健康雛雞于接種后6 h普遍出現精神沉郁等癥狀，12 h后開始出現死亡，72 h內各菌株死亡只數1～3只。死亡率平均66.7%。取死亡或瀕死的雛雞進行解剖取材，進行細菌分離和生化鑒定，回收菌與接種菌一致;對照組健康存活無死亡，未見明顯的臨床癥狀及病變。說明分離菌是對雛雞有致病性的大腸埃希氏菌。

1.3.5 藥敏試驗結果

分離株對丁胺卡那霉素、環丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對慶大霉素、恩諾沙星、妥布霉素中度敏感，對頭孢氨芐、強力霉素、新霉素、青霉素、鏈霉素、紅霉素、阿莫西林、氯霉素、羅紅霉素不敏感。

2 大腸桿菌自家菌苗的制備與檢測

2.1 增菌培養與滅活

將O78、O161、O4血清型菌株純培養物分別接種鮮血瓊脂培養基，37℃培養18 h，用甲醛生理鹽水洗下各型菌株瓊脂平板上菌苔，備用。取少量菌液做細菌計數，用蒸餾水調整各菌液濃度至50億/mL和120億/m L，甲醛終濃度為0.3%，將 O78、O161、O4株菌液按 4∶1∶1 的比例混合，37℃作用 24 h，每隔4 h搖勻一次。

2.2 菌苗制備

Al(OH)3膠佐劑菌苗:將50億/mL混合菌液按5∶1的比例加入滅菌處理過的鋁膠和0.01%硫柳汞，充分搖勻，37℃作用24 h;油佐劑滅活苗:在120億/mL混合菌液中加2%吐溫－80和0.04%硫柳汞搖勻，無菌檢驗后制成水項，油項和水項按3∶1比例乳化制成油佐劑滅活苗。

2.3 無菌檢驗

取滅活菌苗少量樣品分別接種瓊脂平板和肉湯，37℃培養過夜。平板無細菌生長，肉湯呈澄清狀態。說明甲醛滅活完全，無活菌檢驗合格。

2.4 安全性檢驗

取20只健康雞，10只肌肉注射鋁膠菌苗1mL/只，10只注射油佐劑滅活苗1mL/只，連續觀察3 d，雞無外觀癥狀，無病理變化。說明制備的自家菌苗是安全的。

3 防治措施

3.1 隔離與消毒

隔離弱、病雞，防止病原進一步擴散，及時清除病死雞并焚燒深埋，用含碘消毒液噴霧消毒1次/d，連用3 d。

3.2 治療

全群用氧氟沙星飲水，連用5 d，同時補充多種維生素進行輔助治療。

3.3 菌苗接種

發病雞群用鋁膠佐劑菌苗+丁胺卡那霉素(10mg/kg)混勻，0.5mL/羽肌肉注射。育成雞群80～90日齡頸部皮下或肌肉注射油佐劑滅活疫苗，注射劑量為0.5mL/羽。

經采取以上措施，用藥第2天病情好轉，病死雞數量明顯減少，5 d后雞群恢復正常。該批育成雞至產蛋高峰未出現患大腸桿菌的病死雞。

4 小結與討論

(1)本實驗對雞場大腸桿菌的分離培養、生化特性、藥敏試驗、血清學鑒定、動物實驗等做了系列研究，并對鑒定的大腸桿菌進行了增菌培養、活菌計數、甲醛滅活，制備了Al(OH)3膠佐劑菌苗和油佐劑滅活苗，對疫苗進行無活菌和安全性檢驗。根據藥敏試驗結果用藥和接種自家滅活疫苗來治療及防制該場的大腸桿菌病，取得了良好的效果。再次證明規模養殖場疾病的診療通過實驗室檢查，把實驗結果運用于臨床和生產，能最經濟最有效地治療和控制疾病。

(2)由于抗生素的不合理使用及大腸桿菌耐藥質粒和菌株本身的變異，導致了抗生素防治雞大腸桿菌病的局限性。如不進行藥敏試驗，選用抗生素防治大腸桿菌具有很大的盲目性，效果不確定且成本較高。例如有的養殖場雞大腸桿菌對頭孢氨芐高度敏感，對喹諾酮類抗生素耐藥，而該場藥敏試驗結果則恰好相反。在大腸桿菌污染嚴重的雞場，使用菌苗對該病進行生物防治，也存在著一定的局限性，這是由于大腸桿菌血清型很多，又極易產生變異，各地的菌株又不盡相同，相互間的免疫原性也有很大差異。因此，建議使用本場菌株制備的自家菌苗來預防雞的大腸桿菌病。

(3)大腸桿菌病是條件性疾病，只有加強飼養管理、搞好環境衛生、嚴格消毒，實時對致病性大腸桿菌的監測、進行藥物預防和疫苗接種等綜合防治措施的應用才是減少或杜絕大腸桿菌病發生的根本方法。