BAPTA-AM對MDCK細胞的保護作用及其機制

施水娟，宋必衛

(浙江工業大學藥學院，浙江杭州 310014)

肝功能衰竭(hepatic failure，HF)是一種涉及多器官的臨床綜合征，由大面積的肝細胞死亡引起，很快發生多臟器功能衰竭，死亡率高達60% ～90%。目前臨床無有效治療藥物。肝腎綜合征(hepatorenal syndrome，HRS)是在嚴重肝病時發生的急性腎功能衰竭，是HF的重要并發癥與死亡原因。HRS加重病情，使治療更復雜。理論上，一個藥物對肝、腎細胞均有強力保護作用，則用于治療HF更佳:既治療原發病，又能改善并發癥。我們發現進入細胞后活化的高效鈣絡合劑 BAPTA-AM［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N＇N＇-tetraacetic acid］對肝細胞有很強的保護作用，有望開發成肝衰的治療藥［1－2］。

D-氨基半乳糖(D-galactosmine，D-GalN)誘導急性肝損傷模型是目前公認最好的模擬病毒性肝炎病理變化的實驗模型［3］。本文以D-GalN攻擊腎小管細胞(MDCK細胞)以模擬肝腎綜合癥時的腎細胞損傷，通過測定細胞活力，線粒體膜電位(△Ψm)，凋亡通路關鍵酶 Caspase-8、Caspase-9的激活等指標評價D-GalN對腎細胞的毒性和BAPTA-AM的對腎細胞的保護作用及其作用機制，探討其對肝腎綜合癥的有益影響，進一步論證BAPTAAM的治療學價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 MDCK細胞株購自 American tissue culture center(ATCC);D-GalN購自重慶醫科大學;BAPTA-AM 購自 Gibco公司;Rhodamine123、MTT、A23187、Fura-2/AM購自Sigma公司;Annexin V-EGFP、Hoechst33342/PI購自南京凱基生物技術有限公司;Caspase-8、Caspase-9活性檢測試劑盒購自海門市碧云天生物技術研究所;MEM培養液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS購自上海吉諾醫藥生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 垂直流超凈臺(ESCO);CO2培養箱(Forma 3111);倒置熒光顯微鏡(Leica Devices);酶標儀(Molecular Devices，Spectramax M2e);離心機(Heraeus，LDZ5-2)。

1.2 方法

1.2.1 D-GalN誘導MDCK細胞損傷模型的建立將MDCK細胞以104/孔接種于96孔板，MEM培養液，5%CO2，37℃培養至細胞生長到70% ～80%孔面積。每組設6個復孔，實驗重復3次。正常對照組不作處理。模型組加入不同濃度D-GalN，再培養6 h。各孔均加入終濃度0.5 g·L－1的MTT，37℃孵育4 h后DMSO溶解，用酶標儀(λ=570 nm)測吸光度，選擇適當濃度造模。

1.2.2 BAPTA-AM 對 D-GalN誘導 MDCK細胞損傷的影響 細胞分5組，每組6個復孔。正常對照組不作處理;D-GalN模型組加入D-GalN(20 mmol·L－1)，用藥各組在D-GalN攻擊前30 min時加入相應濃度的BAPTA-AM。繼續培養6 h后MTT法檢測細胞活力。

1.2.3 Annexin V-EGFP/PI、Hoechst33342/PI 染色［4］以5×104/孔接種細胞于24孔板，分組處理同“1.2.2”。D-GalN攻擊6 h后棄培養液并用PBS清洗細胞兩遍，分別加入Annexin V-EGFP、PI，室溫避光反應5 min，或hoechst33342、PI(終濃度均為1 mg·L－1)室溫避光反應30 min，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 △Ψm 的檢測［5－6］Rh 123 為膜電位敏感的熒光染料，能選擇性地在活細胞線粒體內聚集，發出黃綠色熒光，其強度可間接反映△Ψm水平。細胞分組與處理同“1.2.2”，每組設3個復孔。棄培養液，PBS清洗兩次，加含10 mg·L－1Rh 123的無血清培養基中37℃孵育30 min后移棄Rh 123，PBS清洗多次至背景較淺，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 細胞內 Caspase-8、Caspase-9 活性檢測［7］基于Caspase-8、Caspase-9分別特異性催化底物Ac-IETD-pNA、Ac-LEHD-pNA產生黃色的pNA，通過于405 nm測定pNA吸光度檢測Caspase-8、Caspase-9的活性。接種于細胞6孔板中，分組與處理同上，收集細胞按照每200萬細胞加入100 μl的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴下裂解15 min，4℃離心(15 000 r·min－1)15 min，取上清液按試劑盒說明檢測。

1.2.6 A23187/CaCl2拮抗實驗［8］Ca2+載體A23187促進Ca2+進入胞內形成Ca2+超載損傷。以104/孔接種細胞于96孔板，分組同“1.2.2”。用藥各組分別加入相應濃度的BAPTA-AM培養30 min后，模型組和BAPTA-AM各組分別加入CaCl20.4 g·L－1和不同濃度的 A23187(0.01 ～ 100 μmol·L－1)，繼續培養4 h，MTT法測細胞活力。

1.2.7 ［Ca2+］i的測定 分組及 D-GalN攻擊同上。用無血清無酚紅的MEM培養液清洗細胞3次。加入終濃度為 5 μmol·L－1的 Fura-2/AM，37℃避光溫育30 min，用無血清無酚紅的MEM培養液清洗3次以去除多余的Fura-2/AM。設定激發波長340 nm，發射波長510 nm，測定熒光強度。再加入0.4%的Triton X-100及5 mmol·L－1CaCl2后測定最大熒光強度值Fmax，在Fmax的基礎上加入10 mmol·L－1EGTA后所測定最小熒光強度值Fmin。按以下公式計算［Ca2+］i:Kd(F－Fmin)/(Fmax－F);Fura-2 與 Ca2+的解離常數 Kd=224 nmol·L－1。

1.2.8 統計處理 用GraphPad Prism軟件處理，數據用±s表示。

2 結果

2.1 D-GalN誘導MDCK細胞損傷模型的建立D-GalN攻擊6 h，細胞活力隨著D-GalN濃度升高呈指數衰減(Fig 1)。當D-GalN濃度為20 mmol·L－1時，細胞活力降低至50.9%，故以該濃度D-GalN攻擊6 h制備MDCK細胞損傷模型。

Fig 1 Inhabitory effect of D-GalN on viabilities of MDCK cells detected with MTT method(±s，n=6)

2.2 BAPTA-AM明顯提高MDCK細胞活力 結果見Fig 2。BAPTA-AM濃度依賴性地減輕細胞損傷，在 5 nmol·L－1時作用最佳(活力為 84.6%)，再增大劑量則作用減弱，提示用藥不可過量。

Fig 2 BAPTA-AM protected MDCK cells from D-GalN induced injury(±s，n=6)

2.3 BAPTA-AM抗細胞凋亡作用 膜磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻、染色質凝集是細胞凋亡重要特征。Annexin V-EGFP選擇性結合外翻的PS，使凋亡細胞綠染。碘化丙啶(Propidium Io-dide，PI)可進入凋亡中晚期或壞死細胞使細胞核紅染，兩者配合使用可將處于不同凋亡時期的細胞區分開。Hoechst 33342是一種可穿透細胞膜的核熒光染料，活細胞核呈彌散均勻藍色熒光，凋亡細胞核則呈致密熒光。

現有研究從宏觀、中觀和微觀不同視角對金融結構影響產業結構升級的機理進行了深入分析，而在各不同傳導途徑中技術進步都扮演著非常重要的角色。主要表現為以下三個方面：(1)在合理高效的金融結構下，資金向著收益率高的部門流動，資金集聚與導向提供激勵，促進技術進步，從而產業結構得以優化提升；(2)國際技術轉移尤其是技術引進推動了我國經濟結構的調整，其中金融結構發揮著重要的作用；(3)金融結構通過刺激“企業家精神”、影響企業的融資約束等因素，影響企業技術創新，推動產業結構高度化。

D-GalN處理后，大量細胞被Annexin V-EGFP綠染，細胞皺縮，膜泡形成，部分細胞碎裂(Fig 3A)，Hoechst 33342染色顯示胞核縮小，呈致密濃染(高亮)(Fig 3C)，呈典型的凋亡特征變化。部分細胞雙重著色(凋亡中晚期)，少量細胞紅染(壞死)。BAPTA-AM有明顯的抗凋亡作用，濃度為5 nmol·L－1時作用最佳(Fig 3B)。

2.4 BAPTA-AM抑制D-GalN所致的△Ψm崩潰由Fig 4可見，D-GalN處理6 h使MDCK細胞線粒體攝取Rh123能力降至正常細胞的21.4%，出現ΔΨm崩潰。BAPTA-AM濃度依賴性維持ΔΨm，表明BAPTA-AM能有效保護線粒體，穩定ΔΨm，維持膜功能，最佳濃度為5 nmol·L－1。

2.5 BAPTA-AM抑制Caspase-8、Caspase-9激活Caspase-8、Caspase-9的活性可反映死亡受體和線粒體凋亡通路的激活程度。由Fig 5可知模型組Caspase-8、Caspase-9活性均約為正常對照組的2倍。BAPTA-AM對Caspase-8、Caspase-9激活均有明顯抑制作用，對后者抑制作用尤強，5 nmol·L－1時幾乎完全抑制其激活。

2.6 BAPTA-AM抑制A23187/CaCl2誘導的細胞損傷 A23187誘導細胞內鈣超載導致細胞損傷。由Fig 6可知，細胞活力隨著A23187濃度的升高而降低。BAPTA-AM濃度依賴性提高細胞活力，5 nmol·L－1時效果最佳。

2.7 BAPTA-AM降低［Ca2+］iD-GalN損傷MDCK細胞后，［Ca2+］i較正常對照組明顯升高。BAPTA-AM劑量依賴性降低［Ca2+］i，其濃度為50 nmol·L－1時，［Ca2+］i達到(149.62 ± 28.41)nmol·L－1，與正常對照組相當，證明BAPTA-AM能完全取消鈣超載。

3 討論

D-GalN是常用的肝毒劑。D-GalN與LPS(內毒素)合用，促進TNF-α生成，通過死亡受體通路誘導大量細胞凋亡，致鼠急性HF［3］。一般認為D-GalN干擾半乳糖代謝，導致三磷酸尿苷耗竭，抑制RNA和蛋白質合成。然而D-GalN的確切毒性機制尚不清楚。本課題組證明D-GalN通過鈣超載損傷肝細胞，致大量細胞凋亡，少量細胞壞死［1］。本文發現D-GalN攻擊 MDCK細胞后，［Ca2+］i明顯升高，細胞活力下降，出現細胞凋亡形態學特征性改變(Fig 3)，細胞凋亡通路激活(Fig 5)和ΔΨm崩潰，充分證明D-GalN能誘導細胞凋亡與壞死，線粒體是其作用的靶細胞器，該結果與人胚肝細胞實驗一致［1］。

Fig 3Morphological analysis of MDCK cells by Annexin V-EGFP/PI or Hoechst 33342/PI double staining(±s，n=6)

Fig 4 Inhibition of BAPTA-AM on dissipation of the ΔΨm of MDCK cells by DGalN attack(±s，n=6)A:ΔΨm was labeled with rhodamine123 and detected by fluorescence microscope;B:Bar graph:quantitative analysis of the mean fluorescent intensity(MFI)analyzed by Image J software.##P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs model group

Fig 5BAPTA-AM blocked activation of caspase-8 and caspase-9 in MDCK cells attacked by D-GalN(±s，n=3)

Fig 6 BAPTA-AM prevented MDCK cells from the injury of ionophore A23187 combined with CaCl2of 0.4 g·L-1(±s，n=6)

Fig 7 BAPTA-AM attenuated cytoplasmic free Ca2+concentrations in MDCK cells attacked by D-GalN(±s，n=6)

一般認為，細胞凋亡存在兩條主要信號通路:線粒體通路死亡受體通路。細胞凋亡與Ca2+超載密切相關。Ca2+超載使線粒體內膜形成通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，膜通透性高，造成線粒體腫脹，ATP耗竭，ΔΨm崩潰，引起細胞凋亡和壞死［9］。同時線粒體外膜形成大孔徑的凋亡誘導孔(mitochondrial apoptosis-inducedchannel，MAC)，細胞色素C(CytC)經此通道釋放到細胞質，進而激活 Caspase-9，始動下游Caspases級聯反應［10］，完成凋亡。我們系列工作證明D-GalN通過Ca2+超載損傷線粒體，使MPTP開放，ΔΨm 崩潰，CytC 釋放［2］，激活 Caspase-9(Fig 5)，即通過線粒體通路引起細胞凋亡。Caspase-8是死亡受體通路的起始者。本文發現D-GalN也能使Caspase-8激活(Fig 5)，提示其對死亡受體通路有易化作用。該結果有助于理解D-GalN與LPS協同誘發急性HF，但其確切分子機制尚待研究。

細胞死亡機制復雜，涉及的信號通路和信號分子很多，僅阻斷某一環節對改善全局幫助不大。而Ca2+超載在多環節參與細胞死亡信號過程。理論上，直接降低［Ca2+］i，迅速消除 Ca2+超載，恢復細胞內Ca2+穩態，可在多環節協同產生高效有益作用，是目前最佳可選策略。由于Ca2+可經多種通道、轉運蛋白、內源儲庫釋放、直接通過損傷的膜等多種途徑進入細胞［11］，故鈣通道阻滯劑療效不佳。

BAPTA-AM是一種快速高效的細胞內Ca2+絡合劑，有效控制 ［Ca2+］i，消除 Ca2+超載［12］。本文工作表明，BAPTA-AM對腎細胞有強力保護作用，能減少細胞凋亡與壞死，大大降低細胞死亡率。該藥通過消除Ca2+超載保護線粒體，穩定ΔΨm，抑制主要凋亡通路激活而產生強大的抗凋亡作用。由Fig 3(雙重熒光染色)可見，BAPTA-AM大大減少凋亡;即使少量細胞發生凋亡，也是處于早期(膜PS外翻)，幾乎見不到中晚期凋亡與壞死細胞。膜PS外翻是可逆轉的改變［13］，處于此期的細胞尚可挽救。該結果與肝細胞實驗結果一致［1－2］。

BAPTA-AM的濃度－效應曲線特點是存在最佳劑量，超過該劑量則作用減弱，故應注意控制劑量。該現象的機制尚不清楚。考慮到5 nmol·L－1時，BAPTA-AM能明顯降低［Ca2+］i但尚未降至正常對照水平，此時效果最佳;而 50 nmol·L－1時［Ca2+］i與正常對照組相當(Fig 7)但藥效有所降低，表明藥效降低并非［Ca2+］i過度下降所致。由此我們提出一種新觀點:如同適度的炎癥、發熱有助于機體康復一樣，細胞受到損傷性刺激時，［Ca2+］i適度升高是一種有益的適應性保護反應，取消這種反應導致療效減弱;［Ca2+］i過度升高則導致嚴重危害反應，必須控制。

我們還發現，BAPTA-AM對腦細胞有很強的保護作用(待發表)。這些結果表明BAPTA-AM是一種很有希望的HF治療藥，不僅護肝，還能對其嚴重并發癥肝腎綜合癥和肝性腦病的產生良好影響，也可能用于腎、腦梗死的治療。該藥作為抗細胞死亡、搶救瀕危細胞藥物，有極佳的研發前景。

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