熱休克蛋白90在氯化鈷對抗血清-葡萄糖剝奪引起的心肌細(xì)胞損傷中的作用

何金蓮，董 頎，林春喜，張 梅，王秀玉，郭潤民，沈 寧，馮鑒強(qiáng)，楊春濤

(1.廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510080;2.廣州醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東廣州 510182;3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院CCU科，廣東 廣州 510080;4.廣州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510182;5.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

血清－葡萄糖剝奪(serum＆glucose derivation，SGD)是血管閉塞后心肌缺血或梗死的病理生理機(jī)制之一。減輕SGD誘導(dǎo)的心肌損害對于缺血/缺氧性心肌疾病的治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和臨床實(shí)用價(jià)值。

長期以來，氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)被認(rèn)為是一種化學(xué)性缺氧模擬劑，可造成組織細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞)的缺血/缺氧性損傷［1］。然而，許多研究顯示，CoCl2可以提高多種細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)和(或)活性，如缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α、血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1以及熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)90等。Xue等［2］的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性上調(diào)心肌組織內(nèi)HIF-1α的表達(dá)可以對抗糖尿病小鼠的心肌損害。本研究組最近的研究顯示，在損傷性濃度(600 μmol·L－1)的CoCl2處理H9c2心肌細(xì)胞(H9c2細(xì)胞)的過程中，HSP90的表達(dá)明顯升高［3］，這可能是一種內(nèi)在的防御機(jī)制。另外，過表達(dá)HSP90可以保護(hù)豬的心臟對抗缺血/再灌注引起的損傷［4］。Budas等［5］進(jìn)一步證實(shí)，HSP90誘導(dǎo)的心肌保護(hù)作用與活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)有關(guān)。然而，低濃度的CoCl2是否可以保護(hù)心肌細(xì)胞對抗SGD誘導(dǎo)的損傷以及HSP90在其中的作用尚未見報(bào)道。

為此，本文擬觀察CoCl2對SGD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響并探討HSP90在CoCl2心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 CoCl2、17-烯丙胺-17-脫甲氧格爾德霉素 (17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG)、雙氯熒光素(2'，7'-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)和羅丹明 123(rhodamine123，Rh123)購自美國Sigma-Aldrich公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counter kit，CCK)-8 購自日本 Dojindo Lab.，DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，兔抗大鼠HSP90抗體購自美國Bio-World公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 H9c2心肌細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，該細(xì)胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的 DMEM-F12培養(yǎng)基中。SGD處理:將H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于不含葡萄糖的培養(yǎng)基中，并不加血清。CoCl2配制成不同的終濃度后，單獨(dú)使用或與SGD共同作用于H9c2心肌細(xì)胞。17-AAG為HSP90的抑制劑，在SGD和CoCl2作用前1 h使用，作為預(yù)處理。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測 H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組4個(gè)復(fù)孔，約80%融合時(shí)，給予不同的處理因素。處理結(jié)束后，每孔加100 μl(1∶10稀釋)CCK-8溶液，輕搖，37℃孵育3 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(optical density，OD)。取4孔OD值的平均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率/%=處理組OD/對照組OD×100%，重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測 按照文獻(xiàn)［1］介紹的方法檢測胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量。當(dāng)細(xì)胞生長到約80%融合時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同的處理:SGD單獨(dú)作用2 h;SGD與CoCl2共同作用2 h;在二者作用前用2 μmol·L－117-AAG預(yù)處理1 h;CoCl2或17-AAG單獨(dú)處理。處理完成后，PBS洗2次，細(xì)胞在10 μmol·L－1DCFH-DA染液中37℃孵育10 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，用Image J 1.41o軟件的Color Histogram模塊分析DCF的平均熒光強(qiáng)度，其大小能反映ROS的含量。

1.5 線粒體膜電位的檢測 按照文獻(xiàn)［1］介紹的方法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)大小。當(dāng)細(xì)胞生長到約80%融合時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同的處理:SGD 24 h;SGD與CoCl2共同作用24 h;在二者作用前用 2 μmol·L－117-AAG預(yù)處理1 h;CoCl2或17-AAG單獨(dú)處理。處理結(jié)束后，用PBS洗2次，在含100 μg·L－1Rh 123的無血清培養(yǎng)基中37℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，細(xì)胞核周圍綠色的亮點(diǎn)即為攝取了Rh123的線粒體。用Image J 1.41o軟件對綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

1.6 Western blot法檢測HSP90蛋白的表達(dá)H9c2心肌細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，約80%融合時(shí)，給予終濃度為 100 μmol·L－1的 CoCl2培養(yǎng)處理6、12 h及24 h;SGD與不同濃度的CaCl2共同處理24 h。處理完成后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液，4℃靜置 30 min。12 000 r·min－1離心10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。隨后加入HSP90抗體(1∶1 000)，室溫孵育2 h，用TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗3次。ECL顯色后，用Image J 1.41進(jìn)行半定量分析，每樣本重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2對抗SGD誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷

Fig 1顯示，H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)SGD處理24 h，細(xì)胞存活率明顯降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在SGD處理同時(shí)，分別應(yīng)用50～400 μmol·L－1的 CoCl2處理 H9c2心肌細(xì)胞，細(xì)胞存活率檢測結(jié)果顯示，50、100 μmol·L－1和 200 μmol·L－1的CoCl2可分別明顯對抗SGD引起的細(xì)胞存活率降低(P ＜0.05)，100 μmol·L－1的 CoCl2在本身不改變細(xì)胞存活率的情況下(數(shù)據(jù)未顯示)，具有最強(qiáng)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用(P ＜0.01)，200 μmol·L－1CoCl2的心肌細(xì)胞保護(hù)作用開始減弱，400 μmol·L－1CoCl2已無心肌細(xì)胞保護(hù)作用(P＞0.05)。因而在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇100 μmol·L－1的 CoCl2作為有效的細(xì)胞保護(hù)濃度。

2.2 CoCl2對抗SGD引起的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)HSP90表達(dá)下調(diào) 通過檢測H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)HSP90 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，100 μmol·L－1CoCl2處理 6 ～24 h可時(shí)間依賴性地上調(diào)HSP90的表達(dá)(Fig 2 A，B)。進(jìn)一步的研究顯示(Fig 2 C，D)，SGD作用24 h可使H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)HSP90的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而在SGD處理過程中給予不同濃度的CoCl2可以不同程度地拮抗SGD誘導(dǎo)的HSP90表達(dá)下調(diào)，其中 50 μmol·L－1的 CoCl2處理開始增加HSP90的表達(dá)，在100μmol·L－1濃度時(shí)達(dá)到高峰，200 μmol·L－1時(shí) HSP90 表達(dá)有所減少，但與 SGD組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。此結(jié)果表明，上調(diào)HSP90的表達(dá)可能是CoCl2對抗SGD誘導(dǎo)心肌毒性的機(jī)制之一。

Fig 1 Effect of CoCl2on SGD-induced decrease in cell viability in H9c2 cells(n=3)

2.3 HSP90介導(dǎo)CoCl2對SGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性的抑制作用 為了進(jìn)一步明確HSP90在CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用，應(yīng)用HSP90的抑制劑17-AAG預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞。結(jié)果顯示(Fig 3)，2 μmol·L－117-AAG 預(yù)處理 1 h 可明顯拮抗CoCl2處理引起的細(xì)胞存活率提高，提示CoCl2保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞對抗SGD誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性至少部分地與其上調(diào)HSP90的表達(dá)有關(guān)。

2.4 HSP90參與CoCl2保護(hù)心肌細(xì)胞對抗SGD引起的ROS水平的升高 氧化應(yīng)激是SGD誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要方式，為了明確CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用是否與其改善氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，本文檢測胞內(nèi)ROS的水平顯示(Fig 4)，SGD處理2 h可明顯提高H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平(P＜0.01)(Fig 4 A-2)，而同時(shí)給予CoCl2可拮抗胞內(nèi)ROS水平的升高(P＜0.05)(Fig 4 A-3)。CoCl2本身不影響胞內(nèi)ROS的水平(Fig 4 A-5)。結(jié)果提示CoCl2的心肌細(xì)胞保護(hù)作用可能與抑制ROS生成有關(guān)。進(jìn)一步的研究證實(shí)，17-AAG預(yù)處理能拮抗CoCl2對ROS生成的抑制作用(Fig 4 A-4)，提示HSP90可能參與CoCl2的抗氧化作用。

Fig 2 Effects of CoCl2and SGD on the expression of HSP90 in H9c2 cells(n=3)

2.5 HSP90參與CoCl2對抗SGD引起的ΔΨm受損 Rh123染色及熒光顯微鏡照相的結(jié)果顯示(Fig 5)，SGD處理24 h可明顯抑制線粒體對Rh123的攝取，提示ΔΨm丟失線粒體功能受損(Fig 5 A-2)，而同時(shí)給予CoCl2可明顯改善線粒體的功能，表現(xiàn)為ΔΨm升高(P＜0.05)(Fig 5 A-3)，CoCl2本身對ΔΨm沒有明顯的影響(Fig 5 A-5)。而在CoCl2和SGD處理前，給予17-AAG預(yù)處理能明顯減弱CoCl2對ΔΨm的改善作用(Fig 5 A-4)，提示HSP90可能參與了CoCl2對線粒體功能的改善作用。

Fig 3 Effect of different treatments on cell viability in H9c2 cells(n=3)

3 討論

缺血性器官損傷是臨床常見的病理生理過程，在體外研究中可以通過SGD的方法來模擬實(shí)現(xiàn)［6－7］。如 Yao 等［6］在 SGD 損傷的心肌細(xì)胞上，探討了存活素的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制。H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期的心臟組織，具有心肌細(xì)胞的許多重要特性和功能，是目前研究心肌細(xì)胞損傷與保護(hù)的常用模型。因而，本文采用 SGD處理H9c2心肌細(xì)胞可為缺血性心肌損傷的研究提供一個(gè)實(shí)用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

本課題組的前期研究顯示，800 μmol·L－1CoCl2處理H9c2心肌細(xì)胞36 h可降低細(xì)胞存活率，增加細(xì)胞凋亡率［1］。但是也有報(bào)道顯示，低濃度的CoCl2處理可上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，并促進(jìn)肝細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞的生長［8］。而低濃度的CoCl2處理是否能保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞對抗缺血引起的損傷，尚未見報(bào)道。本文的結(jié)果顯示，100 μmol·L－1CoCl2處理可明顯抑制SGD誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞存活率降低，這提示低濃度CoCl2處理對心肌細(xì)胞同樣具有保護(hù)作用。

Fig 4 Effect of different treatments on intracellular ROS level in H9c2 cells(n=3)

氧化應(yīng)激是SGD誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的一種重要機(jī)制。抗氧化劑百里醌可保護(hù)PC12神經(jīng)細(xì)胞對抗SGD引起的氧化應(yīng)激損傷［7］。本文研究顯示，SGD處理可使H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯升高，而CoCl2處理可以明顯降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。這和以前關(guān)于高濃度CoCl2處理引起氧化應(yīng)激損傷的報(bào)道［1，3］是不一致的。其中的一個(gè)機(jī)制可能是，高濃度的CoCl2主要以誘導(dǎo)ROS生成為主，而低濃度的CoCl2則主要啟動(dòng)細(xì)胞的一些保護(hù)基因的表達(dá)，繼而通過這些細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)對抗氧化應(yīng)激損傷，但是尚需要更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Fig 5 Effect of different treatments on ΔΨm in H9c2 cells(n=3)

線粒體是缺血性細(xì)胞損傷過程中易受累的細(xì)胞器之一。ΔΨm的丟失是線粒體受損的早期表現(xiàn)，任何原因引起的線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondria permeability transition pore，MPTP)的開放以及 H+跨膜梯度的降低均可導(dǎo)致ΔΨm丟失［9］。MPTP的開放及其引起的細(xì)胞色素C釋放是引起線粒體通路介導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡的原因。Bialik等［10］研究發(fā)現(xiàn)，SGD可引起線粒體功能受損、caspase-3活化及細(xì)胞凋亡，這與本文的結(jié)果類似。重要的是，本文研究發(fā)現(xiàn)CoCl2處理可以減輕SGD引起的ΔΨm丟失，這可能是CoCl2保護(hù)心肌細(xì)胞的另一重要機(jī)制。

為了進(jìn)一步明確CoCl2處理誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)的分子機(jī)制，本文觀察了CoCl2對H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)HSP90表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)SGD處理可明顯抑制胞內(nèi)HSP90的表達(dá)，CoCl2不僅本身可以時(shí)間依賴性地促進(jìn)HSP90的表達(dá)，而且還可對抗SGD引起的HSP90表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步的研究顯示，CoCl2對抗SGD對HSP90表達(dá)的抑制作用與濃度有關(guān)，在50 μmol·L－1時(shí)開始起拮抗作用，100 μmol·L－1時(shí)達(dá)到高峰，200 μmol·L－1時(shí)這種拮抗作用開始降低。Latchman等［11］認(rèn)為，適度地上調(diào)HSP的表達(dá)可以發(fā)揮心肌保護(hù)作用。有研究顯示［5］，過表達(dá)HSP90可以抑制缺血/再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡。HSP90可以通過穩(wěn)定HIF-1α從而誘導(dǎo)多種細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，其機(jī)制與c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)信號通路有關(guān)［12］。重要的是，本文還觀察了HSP90在CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用，即通過應(yīng)用HSP90的選擇性抑制劑17-AAG預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞，探討其對CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用的影響。結(jié)果顯示，抑制HSP90后，CoCl2的抗氧化作用、線粒體保護(hù)以及細(xì)胞存活率的改善作用均被明顯減弱。提示低濃度CoCl2的心肌細(xì)胞保護(hù)作用至少部分地是通過促進(jìn)HSP90表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，這與HSP90介導(dǎo)硫化氫心肌細(xì)胞保護(hù)作用的報(bào)道類似［13］。

綜上所述，本文的研究首次證實(shí)，低濃度CoCl2處理具有對抗SGD引起的心肌細(xì)胞損傷的作用。上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)HSP90的表達(dá)可能是低濃度CoCl2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞保護(hù)的重要機(jī)制之一。然而，CoCl2是通過何種機(jī)制誘導(dǎo)HSP90表達(dá)的，有待于在以后的實(shí)驗(yàn)中深入探討。

［1］ 廖新學(xué)，楊春濤，楊戰(zhàn)利，等.硫化氫對抗化學(xué)性缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷及其機(jī)制［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(8):1012－7.

［1］ Liao X X，Yang C T，Yang Z L，et al.Hydrogen sulfide protects H9c2 cells against chemical hypoxia-induced injury and the underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(8):1012 －7.

［2］ Xue W，Cai L，Tan Y，et al.Cardiac-specific overexpression of HIF-1alpha prevents deterioration of glycolytic pathway and cardiac remodeling in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.Am J Pathol，2010，177(1):97 － 105.

［3］ Yang Z，Yang C，Xiao L，et al.Novel insights into the role of HSP90 in cytoprotection of H2S against chemical hypoxia-induced injury in H9c2 cardiac myocytes［J］.Int J Mol Med，2011，28(3):397－403.

［4］ Kupatt C，Dessy C，Hinkel R，et al.Heat shock protein 90 transfection reduces ischemia-reperfusion-induced myocardial dysfunction via reciprocal endothelial NO synthase serine 1177 phosphorylation and threonine 495 dephosphorylation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(8):1435 － 41.

［5］ Budas G R，Churchill E N，Disatnik M H，et al.Mitochondrial import of PKCepsilon is mediated by HSP90:a role in cardioprotection from ischaemia and reperfusion injury［J］.Cardiovasc Res，2010，88(1):83 －92.

［6］ Yao L L，Wang Y G，Cai W J，et al.Survivin mediates the antiapoptotic effect of delta-opioid receptor stimulation in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120(Pt 5):895 －907.

［7］ Mousavi S H，Tayarani-Najaran Z，Asghari M，et al.Protective effect of Nigella sativa extract and thymoquinone on serum/glucose deprivation-induced PC12 cells death［J］.Cell Mol Neurobiol，2010，30(4):591 －8.

［8］ Piret J P，Lecocq C，Toffoli S，et al.Hypoxia and CoCl2protect HepG2 cells against serum deprivation-and t-BHP-induced apoptosis:a possible anti-apoptotic role for HIF-1［J］.Exp Cell Res，2004，295(2):340 －9.

［9］ Kluck R M，Bossy-Wetzel E，Green D R，et al.The release of cytochrome c from mitochondria:a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis［J］.Science，1997，275(5303):1132 －6.

［10］ Bialik S，Cryns V L，Drincic A，et al.The mitochondrial apoptotic pathway is activated by serum and glucose deprivation in cardiac myocytes［J］.Circ Res，1999，85(5):403 －14.

［11］ Latchman D S.Heat shock proteins and cardiac protection［J］.Cardiovasc Res，2001，51(4):637 －46.

［12］ Zhang D，Li J，Costa M，et al.JNK1 mediates degradation HIF-1alpha by a VHL-independent mechanism that involves the chaperones Hsp90/Hsp70［J］.Cancer Res，2010，70(2):813 －23.

［13］孟金蘭，蘭愛平，楊春濤，等.熱休克蛋白90在硫化氫保護(hù)PC12細(xì)胞對抗化學(xué)性缺氧損傷中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(1):103 －7.

［13］ Meng J L，Lan A P，Yang C T，et al.Role of heat shock protein 90 in protective effect of hydrogen sulfide against PC12 cells injuries induced by chemical hypoxia［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):103－7.