川續斷皂苷Ⅵ誘導大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化的研究

武密山，趙素芝，任立中，王 茹，白 霞，韓紅偉，李 彬

(1.河北醫科大學中醫學院方劑學教研室，河北石家莊 050091;2.石家莊市橋東區醫院，河北石家莊 050041;3.河北醫科大學第一醫院骨科，河北石家莊 050031;4.河北醫科大學生物化學教研室，河北石家莊 050017)

骨髓間充質干細胞(mesonchymal stem cells，MSCs)是理想的組織工程種子細胞［1］。骨髓組織除含有造血干細胞外，還含有MSCs，早期分離培養時，發現其形狀呈成纖維細胞樣而稱為成纖維細胞集落形成單位(colony-forming unit-fibroblastic，CFU-F)，或骨髓基質成纖維細胞(marrow stromal fibroblastic，MSF)，又因其來自骨髓基質而稱為骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。近年來因其在不同誘導條件下，具有向中胚層組織細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等分化的能力，又稱其為間充質干細胞、間充質祖細胞(mesenchymal progenitor cells，MPC)或骨源性干細胞(osteogenic stem cells，OSC)［2］。骨組織由細胞和骨基質組成，各種病因造成的骨質疏松癥(osteoporosis，OP)都表現為破骨細胞(osteoclast，OC)溶解基質形成骨洞的作用超過成骨細胞(osteoblast，OB)形成基質填充骨洞的作用。前期研究表明，由川續斷組成的補腎復方在抑制骨量丟失，改善骨密度方面有明顯療效［3－5］，體外實驗也證實續斷可通過促進成骨細胞增殖、分化，提高成骨細胞的活性和數量，促進基質鈣化、骨痂生長等途徑防治骨質疏松、促進骨折愈合［6］。2010年《中國藥典》指定川續斷皂苷Ⅵ(akebia saponin D，ASD)為川續斷科植物川續斷 Dipsacus asper Wall.ex Henry的含量測定標準，目前國內外ASD對成骨細胞核心結合因子α-1(Cbfα1)mRNA表達影響的研究較少。深入開展ASD誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞的研究，對于研究川續斷抗骨質疏松的作用機制具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑、藥物與動物 噻唑藍、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(日本 Wako公司)，胰蛋白酶(Sigma USA)，Collagenase type Ⅱ(Worthington，USA)，DMEM培養基(Gibco公司)，α-minimal essential medium(α-MEM，Gibco，USA)，胎牛血清(Hyclone 公司)，考馬斯亮藍購自上海生物工程技術服務有限公司。川續斷皂苷Ⅵ(akebia saponin D，ASD批號:110728-201002，購自中國藥品生物制品檢定所，其結構見Fig 1)，ASD用PBS溶液溶解后，調 pH至7.2～7.4，濾膜過濾除菌，－4℃密封保存，使用時用DMEM培養液進行稀釋。6周齡SD大鼠(河北醫科大學實驗動物中心提供)。Northern blot增強化學發光試劑盒(PIERCE)，RT-PCR試劑盒與RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)，RT反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP和Trizol總RNA提取試劑盒均為 MBI公司產品，Cbfα1 ELISA 試劑盒(ADL，USA)，Cbfα1和 GAPDH 引物由 Invitrogen公司合成，Cbfα1 引物序列:上游 5'-ATGCTTCATTCGCCTCACAAAC-3'，下 游 5'-CCAAAAGAAGCTTTGCTG-3'，擴增片段長度為261 bp。內參GAPDH引物序列:上游 5'-GACTACCTCATGAAGATCCT-3'，下游5'-GCGGATGTCCACGTCACACT-3'，擴增片段長度為313 bp。

Fig 1 Chemical structure of Akebia saponin D

1.1.2 儀器 CO2恒溫培養箱(美國 SHELL LAB)，96 孔培養板(Costar，USA)，35 mm 組織培養皿(Corning-Costar，NY，USA)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，UV 1601紫外分光光度計(日本島津)，DYY-Ⅲ-7 B穩壓穩流型電泳儀(北京六一儀器廠)，PCR 擴增儀(Gene Amp PCR System 2400，美國)，Gel Doc 2000凝膠成像系統(美國BIO RAD)，美國MIS-2000 SP型3 Y顯微圖像分析儀，3 Y分析軟件(Pro，Ver，4.0)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質干細胞的分離純化、培養擴增 參照文獻［7］并作改進，選用6周齡健康SD大鼠，頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離股骨脛骨，切去骨兩端，用含 15%FBS、100 kU·L－1青霉素 G、100 mg·L－1硫酸鏈霉素的α-MEM(含酚紅)沖洗骨髓腔得到骨髓細胞懸液，1 000 r·min－1，離心10 min，棄上清。用L-DMEM重懸細胞，將細胞懸液貼壁輕輕加入到預置等體積淋巴細胞分離液(比重1.077)的離心管中，2 000 r·min－1，離心 30 min。收集云霧狀白膜層的單個核細胞，用L-DMEM洗滌兩次(1 000 r·min－1，離心 5 min)，用含 10% 新生小牛血清、1×105U·L－1青霉素、1 ×105U·L－1鏈霉素的L-DMEM培養基重懸。以1×108·L－1接種細胞于培養瓶中，于飽和溫度37℃、pH 7.2條件下培養于5%CO2恒溫培養箱。5 d時首次換液，以后每周換液兩次，根據細胞貼壁性能不同，每次換液棄除懸浮生長的造血系細胞，每次傳代用0.25%胰蛋白酶(0.1 ml·cm－2)消化2 min，將 MSCs與混雜的淋巴細胞、單核細胞分開，重復上述操作，反復傳代擴增，使MSCs得到純化。然后將MSCs培養條件改為無酚紅α-MEM培養液中繼續培養，進行以下分組，供實驗待用。

1.2.2 實驗設計分組 實驗共分 4組:對照組(control，無酚紅α-MEM)，川續斷皂苷Ⅵ用無酚紅α-MEM 培養液稀釋成以下低(L-ASD，0.1 μmol·L－1)、中(M-ASD，1 μmol·L－1)、高(H-ASD，10 μmol·L－1)不同濃度培養組，每組藥物濃度均設8個平行孔。

1.2.3 大鼠骨髓MSCs的生長曲線測定 各組細胞用質量濃度為0.25 g·L－1胰蛋白酶消化，1×108·L－1接種于96孔板，每天各取8孔計數，每孔計數5次，計算均值，連續8 d。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，描繪生長曲線。計算群體倍增時間:TD=t［log 2/(log Nt－ log No)］，No 和 Nt分別代表接種后和培養t小時的細胞數。

1.2.4 成骨細胞內堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)活性測定 將各組MSCs誘導分化過程中細胞在第4，5，6天時用 PBS洗滌細胞2次，0.04 g·L－1蛋白酶 E(含 1.25 mmol·L－1EDTA)，消化并收集細胞。細胞內ALP活性測定底物為9×10－2mol·L－1pNPP，反應液 pH 為 10.3，37℃反應 30 min，加0.1 mol·L－1NaOH終止反應，400 nm處測定吸光度，同時用考馬斯亮藍測定培養細胞蛋白質含量。ALP 活性表示為 mmol·L－1·min－1·g－1Pro。

1.2.5 骨鈣素(osteocalcin，OC)檢測 試驗方法及藥物和濃度同1.2.4，每組各設8孔，各組分別誘導至第4，5，6天時，分別取培養液進行細胞的骨鈣素含量測定，采用雙抗夾心ELISA法。以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。根據樣品的OD值在標準曲線上查出其濃度，以μg·L－1表示，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.6 RT-PCR 法檢測 Cbfα1 mRNA 表達 ① 組織總RNA提取:采用異硫氰酸胍－苯酚－氯仿一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，A260/A280均在1.8～2.0。總RNA濃度=OD260值×8(g·L－1)，用前調整濃度至 1 g·L－1。② 反轉錄(reverse transcription，RT):所提取總 RNA 1 μl加入0.5 μl Oligt dT(500 mg·L－1)，離心混勻后加入:dNTP(mix)2 μl，5 × buffer 6 μl，R Nase Ribonuclease Inhibitor 1 μl，AMV-RT 1 μl，無菌 DEPC 水 8.5 μl，反應體系為 20 μl，振蕩混勻，42℃ 60 min，90℃ 5 min，4℃ 5 min。③ PCR 反應:2 × Primer 2 μl，Taq聚合酶 buffer 2.5 μl，Taq 聚合酶 0.5 μl，dNTP 2 μl，樣本模板 2 μl，DEPC 水 16 μl，總反應體積為 25 μl。④ PCR擴增條件:Cbfα1:94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min共30個循環。β-actin:94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min共25個循環，72℃ 5 min，4℃保存。⑤ 瓊脂糖凝膠電泳:取擴增產物10 μl與溴酚藍上樣緩沖液2 μl混合后行質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果在凝膠成像分析系統中分析基因條帶的光密度值，并求出與內參照基因GAPDH的光密度比值。

2 結果

2.1 各組成骨細胞的生長曲線 各組生長曲線圖形基本相似，經過1～3 d的潛伏適應期后進入對數生長期，第6天達頂點，以后進入平臺期，群體倍增時間平均約48 h。與對照組(control)相比，川續斷皂苷Ⅵ低濃度組(L-ASD，0.1 μmol·L－1)OB 的生長曲線差異無顯著性(P＞0.05)。川續斷皂苷Ⅵ中濃度組(M-ASD，1 μmol·L－1)和川續斷皂苷Ⅵ高濃度組(H-ASD，10 μmol·L－1)OB 的生長曲線明顯升高(P＜0.01)，提示大鼠骨髓MSCs在川續斷皂苷Ⅵ中、高濃度穩定擴增，未出現衰老征象，有較強的擴增潛能。見Fig 2。

Fig 2 Cells growth curve of akebia saponin D

2.2 川續斷皂苷Ⅵ對大鼠骨髓MSCs誘導分化為成骨細胞過程中堿性磷酸酶(ALP)活性的影響與對照組相比，川續斷皂苷Ⅵ低濃度組對大鼠骨髓MSCs誘導分化為OB過程中第4、5、6天的ALP活性差異無顯著性(P＞0.05)。川續斷皂苷Ⅵ中濃度組和川續斷皂苷Ⅵ高濃度組對大鼠骨髓MSCs誘導分化為OB過程中第4、5、6天的ALP活性明顯升高(P＜0.01)。見 Tab 1。

Tab 1 Effects of akebia saponin D on ALP activity in different concentrations of MSCs cells to osteoblasts during differentiation(mmol·L－1·min－1·g－1Pro，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 Incubation time/d 4 5 6 Control － 2.51 ±0.12 3.16 ±0.14 3.62 ±0.14 L-ASD 0.1 2.62 ±0.16 3.31 ±0.17 3.75 ±0.18 M-ASD 1 3.23 ±0.13＊＊ 3.49 ±0.16＊＊ 3.84 ±0.16＊＊H-ASD 10 3.75 ±0.15＊＊ 3.56 ±0.12＊＊ 3.98 ±0.15＊＊

2.3 川續斷皂苷Ⅵ對大鼠骨髓MSCs誘導分化為成骨細胞過程中骨鈣素(OC)的影響 與對照組相比，川續斷皂苷Ⅵ低濃度組對大鼠骨髓MSCs誘導分化為OB過程中第4、5、6天的骨鈣素差異無顯著性(P＞0.05)。川續斷皂苷Ⅵ中濃度組和川續斷皂苷Ⅵ高濃度組對大鼠骨髓MSCs誘導分化為OB過程中第4、5、6天的骨鈣素明顯升高(P＜0.01)。見Tab 2。

Tab 2 Effects of akebia saponin D on osteocalcin in different concentrations of MSCs cells to osteoblastsduring differentiation(μg·L－1，±s，n=8)

Tab 2 Effects of akebia saponin D on osteocalcin in different concentrations of MSCs cells to osteoblastsduring differentiation(μg·L－1，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 Incubation time/d 4 5 6 Control － 51.36±2.32 53.16±2.24 54.19 ±2.37 L-ASD 0.1 53.18 ±2.27 55.07 ±2.26 56.16 ±2.31 M-ASD 1 54.98±2.35＊＊ 56.48±2.34＊＊ 57.13 ±2.34＊＊H-ASD 10 55.38±2.39＊＊ 57.39±2.71＊＊ 58.64 ±2.17＊＊

2.4 川續斷皂苷Ⅵ對大鼠骨髓MSCs誘導分化為成骨細胞過程中Cbfα1 mRNA表達的影響 與對照組相比，川續斷皂苷Ⅵ低濃度組對大鼠骨髓MSCs誘導分化為OB過程中第5天的Cbfα1 mRNA表達差異無顯著性(P＞0.05)。川續斷皂苷Ⅵ中濃度組和川續斷皂苷Ⅵ高濃度組對大鼠骨髓MSCs誘導分化為OB過程中第5天的Cbfα1 mRNA表達明顯升高(P＜0.01)。見Tab 3。

3 討論

干細胞可分為三種類型:一類是全能干細胞，如胚胎干細胞，來源于胚胎早期原始生殖細胞，可分化為機體所有類型細胞;第二類是多能干細胞;第三類是專能干細胞。第二、三類干細胞存在于成年組織中，又稱成體干細胞，如造血干細胞、神經干細胞、間充質干細胞，可分化為一、二種類型的分化細胞。傳統認為骨髓MSCs的主要功能是參與造血干細胞生存和分化，近年發現還具有向多種細胞系轉化的潛能，自體獲取的骨髓MSCs回輸后不會發生免疫排斥反應，體外基因轉染率高，骨髓MSCs成為組織工程、基因治療的研究熱點［8－9］。成年后長骨骨髓腔內以黃骨髓(含脂肪細胞多)為主，若以此為骨髓MSCs的來源，則脂肪細胞多，MSCs很少;幼年動物骨髓腔內以未分化幼稚細胞為主，本實驗骨髓MSCs分離、純化選擇了具有多向分化潛能的幼年動物的骨髓MSCs為誘導成骨細胞的來源。

Tab 3 Effects of akebia saponin D on expression of Cbfα1 mRNA in different concentrations of MSCs cells to osteoblasts during differentiation(±s，n=8)

Tab 3 Effects of akebia saponin D on expression of Cbfα1 mRNA in different concentrations of MSCs cells to osteoblasts during differentiation(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 Cbfα1/β-actin/%Control － 6.58 ±2.12 L-ASD 0.1 8.03 ±2.49 M-ASD 1 10.27 ±2.64＊＊H-ASD 10 11.02 ±2.81＊＊

目前對于骨髓中MSCs的分離、純化、培養還沒有統一的方法，比較常用的方法是密度梯度離心法、貼壁細胞分離法、流式細胞儀和免疫磁珠分離法。實驗中我們把密度梯度離心法與貼壁細胞分離法相結合，首先根據比重差別，用比重為1.077的淋巴細胞分離液分離骨髓MSCs，經密度梯度離心后，能有效地將絕大部分紅細胞、粒細胞、脂肪細胞和血小板除去，獲得純度較高的單個核細胞，然后利用貼壁細胞分離法，根據骨髓MSCs貼壁生長而造血系細胞懸浮生長的特性差異，隨換液棄除懸浮生長的造血細胞，剩下的是貼壁生長的MSCs，經幾次傳代，對二者進行完整分離，從而使MSCs得到進一步純化。

MSCs生長曲線顯示為潛伏適應期、對數生長期和平臺期，每個時期的細胞系都有其特性，從生長曲線的形狀，判定骨髓MSCs的生長繁殖潛力基本穩定，細胞為均一的成纖維樣細胞，潛伏適應期在第1～3天，對數生長期為第4～6天，以后進入平臺期，在對數生長期，群體倍增時間46 h，傳代周期約7 d，每傳代一次細胞增加約3.2倍，高、中濃度的川續斷皂苷Ⅵ與對照組相比，生長曲線有明顯差異。隨著成骨細胞分化的逐漸進展，其增殖能力減弱，到成熟的成骨細胞不具備增殖能力［10］。ALP是主要分布于細胞膜的鈣結合轉運蛋白，促進細胞成熟、鈣化［11］。骨鈣素是骨質鈣化必需的因子，維持骨組織的正常礦化［12］。ALP和骨鈣素分別是成骨細胞早期和中期分化的標志物［13－14］。實驗發現加入誘導劑高、中濃度的ASD組，誘導分化的細胞具有與成骨細胞相似的形態和生長特征，與對照組相比，堿性磷酸酶活性增強，骨鈣素含量增加，說明ASD誘導分化為成骨細胞的作用較強。

核心結合因子α1(core-binding factor alpha 1，Cbfα1)是脊椎動物成骨細胞分化的關鍵調節因子，除了作為核蛋白與成骨細胞上的特異順式作用元件結合以激活骨鈣素表達外，還調節所有關鍵成骨細胞基因的表達，在成骨細胞分化中起主要作用。Cbfα1基因缺失沒有其它平行通路可取代Cbfα1的作用［15－16］。Cbfα1 還能控制分化的成骨細胞進一步成骨，控制分化成骨細胞的成骨速率，調節骨鈣素基因(bgp)表達，bgp的表達僅限于分化完全的成骨細胞，該基因的啟動子上存在2個成骨細胞特異順式作用元件OSE 1和OSE 2。胚胎發育時Cbfα1的表達限于成骨細胞，Cbfα1是骨生成最早和最特異的標志，而作用于Cbfα1上下游的轉錄因子可能為非特異性的［17］。本實驗研究表明，Cbfα1與骨髓基質細胞向成骨細胞分化過程密切相關，中、高濃度的ASD可使該過程中Cbfα1 mRNA的表達加強，Cbfα1 mRNA的表達始于成骨細胞誘導分化的早期，至第6天時達到高峰，并持續表達于成骨分化全過程中。

綜合本實驗結果認為，川續斷皂苷Ⅵ具有促進MSCs增殖和向成骨細胞分化的能力，并在基因水平上為篩選促進骨形成的有效藥物提供了作用靶點，詳細的機制有待于進一步研究。

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