石墨烯氧化物抗菌效果的測定方法比較

呂 敏 張 歡 諸 穎 黃 慶 趙 云

1 (中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800)2 (四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 成都 610000)

石墨烯氧化物(Graphene Oxide, GO)是石墨烯(Graphene)的衍生物，由石墨粉經(jīng)多步氧化、超聲純化等步驟制備而成，系單層蜂窩狀的二維納米碳材料，表面具有活性含氧功能基團(tuán)(環(huán)氧基、羧基、羥基等)[1,2]。GO具有很好的水溶性，廣泛應(yīng)用于生物傳感器[3,4]、藥物輸送[5–7]、生物成像等領(lǐng)域。

石墨烯氧化物具有良好的抗菌性能[8–10]，大腸桿菌與GO材料孵育2 h后，90%的大腸桿菌被殺死[11]。然而，文獻(xiàn)[12]報(bào)道石墨烯氧化物可非特異地促進(jìn)細(xì)胞生長。同樣的材料，是什么原因?qū)е陆厝幌喾吹慕Y(jié)果? 比對多篇文章發(fā)現(xiàn)，GO抗菌性結(jié)果的差異主要由不同的抗菌性方法引起。

在微生物學(xué)中，抗菌效果的研究主要是檢測微生物在抗菌劑作用前后數(shù)目的變化。常用的有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、光電比濁度法(turbidity estimation by spectrophotometer)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count assey)、膜過濾法(membrane filtration)等[13]。同一種抗菌劑，使用不同的檢測方法，會有不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[14–16]。本文以石墨烯氧化物為研究對象，比較了光電比濁計(jì)數(shù)法、抑菌環(huán)法和平板菌落計(jì)數(shù)法測定GO的抑菌效果，以探索能真實(shí)、客觀呈現(xiàn)GO抗菌性的方法，為生物學(xué)方法正確應(yīng)用于材料領(lǐng)域提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌(Escherichia coliDH5a)，購買于碧云天生物技術(shù)有限公司。LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani broth)：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g(購自上海國藥集團(tuán))，蒸餾水1 L定容，調(diào)至pH7.0(120oC高壓滅菌，冷卻后4oC冰箱保存)。LB瓊脂培養(yǎng)基：每1 L LB培養(yǎng)液加入15 g瓊脂(120oC高壓滅菌備用)。

石墨烯氧化物(Graphene oxide, GO)采用改良的Hummers方法合成[17]，制備過程如下：(1) 預(yù)氧化：將10 g石墨粉加入80oC的含有濃H2SO4(60 mL)、過硫酸鉀(15 g)和五氧化二磷(15 g)的混合體系中，反應(yīng)5 h。冷卻至室溫后，用大量超純水洗滌、過濾，至清洗后的水呈中性為止，抽濾所得沉淀在空氣中自然干燥。(2) 氧化：將 2 g預(yù)氧化的石墨粉加至150 mL冰水浴的濃H2SO4中，攪拌均勻后，再加入25 g的高錳酸鉀。35oC水浴反應(yīng)4 h，冷卻至室溫，250 mL超純水緩慢稀釋(保持溫度低于45oC)，再加入1 L超純水，后緩慢加入30 mL 30%的H2O2終止反應(yīng)。(3) 后處理：1:10(V/V)鹽酸水溶液(1 L)洗滌兩次，除去金屬離子；再用1 L超純水洗滌，除去多余的酸；樣品超聲2 h，將上層的穩(wěn)定懸浮液透析3天，進(jìn)一步除去殘留的金屬離子和其他陰離子，定濃度為1 mg/mL備用。

1.2 石墨烯氧化物表征

將GO懸液(約10 μL)滴于云母片上，在空氣中自然干燥。用原子力顯微鏡(AFM，美國Veeco公司)在2 μm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，用Nanoscope軟件分析其形貌、粒徑、分散情況。

將GO稀釋到適合濃度，使用1 cm內(nèi)徑的石英比色皿，加入液體1.5 mL，用紫外可見分光光度計(jì)(UV-Vis，日立集團(tuán))在200–700 nm波段以1200 nm/s的速度掃描GO樣品。

1.3 大腸桿菌的培養(yǎng)

從活化的大腸桿菌 DH5a平板挑取一個(gè)單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜增殖。取1 mL對數(shù)生長期的大腸桿菌DH5a菌液，10,000 r/min離心1 min收集沉淀，用滅菌的生理鹽水(0.9%NaCl)洗3次，測定大腸桿菌在600 nm處的吸光值，估算大腸桿菌的數(shù)量。

1.4 光電比濁計(jì)數(shù)法測定抗菌性

大腸桿菌 DH5a(～107個(gè))分散于石墨烯氧化物終濃度為100 μg/mL的生理鹽水中，在37oC中輕柔震蕩4 h。取100 μL作用后的懸液加入2 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，在37oC、200 r/min恒溫?fù)u床孵育過夜，測定OD600值。

1.5 平板菌落計(jì)數(shù)法測定抗菌性

取100 μL作用后的懸液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍。然后從每個(gè)稀釋梯度液中取100 μL均勻涂在LB瓊脂平板上，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，倒置于37oC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)稀釋濃度涂布3塊平板，重復(fù)三次取平均值。

1.6 抑菌環(huán)法測定抗菌性

取100 μL大腸桿菌DH5a菌液，均勻涂在LB瓊脂平板上，在37oC培養(yǎng)箱中孵育30 min；取無菌干燥的直徑為 6 mm的濾紙片，每片滴加 100μg/mL GO 20 μL，將濾紙片平放于無菌清潔培養(yǎng)皿中，自然干燥，輕輕置于LB瓊脂平板表面，倒置于37oC恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，觀察并測量抑菌圈的大小。用無菌生理鹽水浸泡的濾紙片作為陰性對照，氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)浸泡的濾紙片作為陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯氧化物表征

所制備的GO為棕色膠狀懸液，顏色隨濃度逐漸加深，透光率減小。AFM成像顯示：GO的厚度～1.1 nm，側(cè)邊尺寸不均一，分布在數(shù)十 nm至數(shù)μm(圖1a)。紫外可見光譜(圖1b)顯示GO在230 nm有一個(gè)特征吸收峰，表明已成功合成具有良好分散性的單片層GO。

圖1 石墨烯氧化物的原子力顯微鏡成像(a)和紫外可見分光光度法光譜(b)Fig.1 AFM image (a) and UV-vis spectrum (b) of graphene oxide.

2.2 抑菌環(huán)法測定石墨烯氧化物抗菌性

抑菌環(huán)的直徑越大，抗菌劑的抗菌性能越好，反之亦然。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性對照氨芐卡那霉素(Ampicillin, Amp)有明顯的抑菌環(huán)，直徑約23 mm，顯示強(qiáng)抗菌性；石墨烯氧化物與陰性對照相同，未產(chǎn)生抑菌環(huán)，說明此方法顯示GO無抗菌性(圖2)。

2.3 光電比濁度法測定石墨烯氧化物抗菌性

大腸桿菌與石墨烯氧化物孵育4 h后，取100μL培養(yǎng)液于新鮮LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，圖3(a)顯示，GO組與對照組培養(yǎng)基均呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明有大腸桿菌生長；氨芐卡那霉素組培養(yǎng)基澄清，顯示了強(qiáng)抗菌性。大腸桿菌存活率(OD600)測定顯示(圖3b)：GO組與對照組的細(xì)胞數(shù)幾乎一致，而氨芐卡那霉素組細(xì)菌數(shù)幾乎為零，表明石墨烯氧化物無抗菌性。此結(jié)果與文獻(xiàn)[12]一致，其原因可能是LB培養(yǎng)基中的蛋白胨吸附于GO表面，使GO發(fā)生團(tuán)聚(圖3a的GO試管底部有明顯的黑色團(tuán)聚物)，失去與細(xì)胞充分接觸的空間位點(diǎn)[12]。

圖2 抑菌環(huán)法測定石墨烯氧化物抗菌性Fig.2 Antibacterial property of GO by inhibition zone method.

2.4 平板菌落計(jì)數(shù)法測定石墨烯氧化物抗菌性

我們用菌落計(jì)數(shù)法測定100 mg/mL的石墨烯氧化物對大腸桿菌DH5α的抑菌率。結(jié)果表明，在GO作用下，大腸桿菌菌落明顯少于對照組，接近陽性對照氨芐卡那霉素(如圖4a)。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，石墨烯氧化物與大腸桿菌作用4 h后，約80%的細(xì)菌被殺死(圖4b)，證實(shí)石墨烯氧化物具有優(yōu)異的抗菌性能。這可能是因?yàn)镚O與大腸桿菌在生理鹽水中充分接觸導(dǎo)致細(xì)胞膜受到機(jī)械性損傷，細(xì)胞死亡[8,9]。

不同的實(shí)驗(yàn)測定方法顯示 GO不同的抗菌效果，我們認(rèn)為主要與石墨烯氧化物本身的物理化學(xué)性質(zhì)相關(guān)。抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)法是利用抑菌劑在LB平板表面具有一定的擴(kuò)散性，從而殺死濾紙邊緣的細(xì)菌，形成明顯的抑菌環(huán)。石墨烯氧化物作為一種不可溶解的納米材料，其水溶液滴加在濾紙上不具有擴(kuò)散性，無法形成明顯的抑菌環(huán)，因此，該方法不能準(zhǔn)確反映GO是否具有抗菌性。光電比濁法測定GO抗菌性時(shí)，由于GO具有大的比表面積，表面可吸附蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子[18]，GO置于LB培養(yǎng)基時(shí)，易吸附培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)而團(tuán)聚(圖3a)，形成易于細(xì)菌生長的附著點(diǎn)，維持甚至促進(jìn)細(xì)菌的生長[12]。團(tuán)聚狀態(tài)GO不能真實(shí)反映單片層GO的理化性質(zhì)，因此，該方法也不適于研究單層石墨烯氧化物的抗菌性。然而，平板菌落計(jì)數(shù)法克服了LB液體培養(yǎng)基對GO穩(wěn)定性影響的因素，大腸桿菌與GO懸液充分接觸后，平板計(jì)數(shù)直接反映作用后的細(xì)菌數(shù)目，避免了其他干擾因素，客觀準(zhǔn)確地反映石墨烯氧化物的抗菌性。

圖3 光電比濁法測定石墨烯氧化物抗菌性(a) GO處理大腸桿菌的數(shù)碼成像，生理鹽水為陰性對照，氨芐青霉素為陽性對照；(b) 大腸桿菌的存活率Fig.3 GO-affected antibactericial activity determined by spectrophotometer turbidity estimation.(a) Digital image of GO-treated E.coli, with, 0.9% NaCl as control and ampicillin as positive control;(b) Viability of E.coli by measuring OD600

圖4 菌落計(jì)數(shù)法測定石墨烯氧化物的抗菌性(a) 大腸桿菌的菌落直觀圖，(b) 石墨烯氧化物對大腸桿菌的抑菌率Fig.4 GO-affected antibacterial activity determined by plate count assay.(a) Digital image of colony-forming unit of E.coli, (b) Antibacterial activity of GO against E.coli

3 結(jié)語

通過三種方法測定石墨烯氧化物抑菌效果，可見不同的測定方法得到不同的結(jié)果。結(jié)合理論分析，我們認(rèn)為平板菌落計(jì)數(shù)法能準(zhǔn)確地呈現(xiàn)GO與大腸桿菌的作用效果，適合于GO抗菌性的檢測，為GO

抗菌性研究提供了有效的實(shí)驗(yàn)方法。

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