黃鱔T淋巴細胞數量的檢測比較試驗

黃鱔具有很好的食用價值、藥用價值和研究價值。黃鱔養殖業的發展，推動了其產品加工的發展，目前已有簡單包裝的生鮮凍鱔片和凍鱔絲的生產，也有真空軟包裝的休閑食品柳葉鱔絲、醋熏鱔片及酥香鱔骨的生產，還有鱔血酒及全鱔藥用酒的生產。同時，由于鱔魚體內富含DHA和藥用成分，國內外已在深加工和保健品方面進行研究開發。黃鱔的全身除了頭和內臟，基本上都可用于加工生產食品和藥品。因此，黃鱔的市場開發價值較大，有很好的發展空間。

早期玫瑰花環形成的T淋巴細胞是對SRBC具有高度親和力的T細胞亞群，它與T細胞的體內外功能活性密切相關，能更敏感地反映機體細胞免疫的水平和動態變化，是目前檢測細胞免疫水平最為簡便快速的方法之一。在總玫瑰花環試驗中，靜止期和活動期的T淋巴細胞，均能與不同數量的SRBC自發形成E花環，所得E花環的百分率和絕對數可代表被檢標本中全部T淋巴細胞的百分率和總數。是目前鑒定和計算外周血液和各種淋巴樣組織中T淋巴細胞的最常用方法之一。通過對黃鱔T淋巴細胞的測定，可以了解不同發育階段黃鱔的免疫活性，運用到實踐上，可以對不同階段的黃鱔的免疫力的強弱進行針對性的照料，當其免疫力弱時，可以加強防病治病的力度，從而達到科技運用到實踐中的目的。

材料與方法

·實驗材料

1、實驗動物

白兔:購于荊州沙市區鐘鼓樓菜市場，體重1.32kg，試驗前常溫飼養10天。

不同規格的黃鱔15條，購于荊州花鳥魚市場，試驗前22℃飼養7天，數據如表1所示。

2、實驗器材

離心機；移液槍；槍頭；水浴鍋；EP管；注射器；顯微鏡；計數板；載玻片；蓋玻片；高溫滅菌鍋；冰箱；制冰機等。

3、實驗試劑

瑞氏粉；甲醇；甘油；姬姆薩氏粉；戊二醛；碳酸氫鈉；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；小牛血清；檸檬酸鈉；檸檬酸；氯化鈉；percoll分層液；蒸餾水；氯化鉀；氫氧化鈉等。

· 實驗方法

1、黃鱔血液的制備

（1）取出黃鱔，用剪刀剪斷其脊椎，使其癱瘓，失去抵抗。

（2）用剪刀對準肛門下方少許處斜向剪斷尾部，將斷口對準事先準備好的裝有阿式液的EP管，血液自然流進EP管。

（3）當血液量少的時候可以適當輕擠黃鱔軀體，使血液能更多的被采集。

（4）將收集好的血液存放在碎冰上備用。

2、黃鱔淋巴細胞的分離

（1）將1份10€譖BS與9份Percoll貯存液混合，制成等滲Percoll懸液，此懸液被認為是100 % Percoll懸液，其密度為1.1294 g/ml。

（2）用PBS稀釋100% Percoll而獲得所需密度的Percoll分離液。

（3）用稀釋液稀釋60 %則此時的Percoll分離液比重為1.0777g/ml，即可用于淋巴細胞的分離。

（4）取5ml的Percoll分離液于10ml的EP管中，將等倍稀釋的黃鱔血液0.5ml小心疊加在分離液上。

（5）將EP管放在離心機上進行離心（1500rpm/min，10min）

（6）離心之后將EP管取出，可以看到EP管中有四個細胞層，從上到下第二層為淋巴細胞。

（7）用10um的移液槍小心的將這層細胞吸出，即為比較純的淋巴細胞，將其收集好放在碎冰上備用。

3、兔紅細胞的采集

（1）取5ml的注射器，用阿式液潤洗。

（2）將白兔取出，按住其四肢和耳朵，讓其面朝上躺著不能動彈。

（3）將注射器插入其心臟，緩緩抽出2ml血液，將血液迅速移入裝有阿式液的EP管中，上下輕輕轉動，讓血液充分和阿式液混合。

（4）將制備好的兔血液放在碎冰上備用。

4、兔紅細胞和黃鱔淋巴細胞的計數

（1）將采集好的兔紅細胞稀釋100倍，充分混勻。

（2）用移液槍吸取少量混液，小心的加在計數板上。

（3）將計數板放在顯微鏡下進行計數，計算出原兔紅細胞的密度，配制出所需濃度的兔紅細胞懸液

（4）用同樣的方法配制出黃鱔淋巴細胞懸液。

5、玫瑰花環的形成

（1）取0.3ml小牛血清于1ml的EP管中，再加入0.3ml兔紅細胞和0.1ml黃鱔淋巴細胞，混勻。

（2）將EP管放在37℃水浴鍋中反應25min。

（3）將EP管取出，放在離心機里離心（500 rpm/min，5min）。

6、玫瑰花環的制片、染色及鏡檢；

（1）將1滴反應好的培養物滴在玻璃片上，用槍頭將其均與的涂抹在一定范圍之內。

（2）將玻璃片放在一邊讓其自然干燥，干燥后滴加1滴甲醛在上面，5min后用6.4的PBS液沖洗。

（3）等其自然干燥后再滴加瑞式液，4min后再用6.4的PBS液沖洗。

（4）等其自然干燥后再滴加吉姆薩式液，4min后用6.4PBS液沖洗，干燥。

（5）每份培養液制備3份玻璃片。

（6）將制備好的玻璃片放在顯微鏡下進行觀察，凡吸附3個或更多家兔紅細胞的單核細胞，為RE花環形成細胞，共計數100個細胞，計算出百分率

不同規格黃鱔T淋巴細胞數量的比較（如表2所示）

通過上面表格可以看到，隨著黃鱔規格的變大，其E玫瑰花環形成率逐漸增高，這也就是說，隨著黃鱔的長大，其免疫力會逐步增強，而小黃鱔的免疫力最弱，在生活當中，應該更加注重黃鱔幼體的防病抗病工作。

（作者單位：長江大學動物科學學院）