抗HBV-DC聯合藥物治療e抗原陽性的臨床研究

劉勇 吳邦富 胡媛媛

[摘要]目的 觀察HBsAg致敏自體外周血單個核細胞（PBMC）來源的樹突狀細胞聯合拉米夫定和胸腺肽α1治療HBeAg陽性慢乙肝的臨床效果。 方法 HBeAg陽性CHB患者20例接受臨床研究。取肝素抗凝外周靜脈血50mL，以密度梯度離心及貼壁法獲得PBMC，GM-CSF和IL-4誘導擴增DC，第6天給予30 μg的HBsAg致敏DC，第7天收獲抗HBV-DC。聯合拉米夫定和胸腺肽α1，分別于0、4、12周檢測HBVM定量和HBV-DNA定量及肝功能。 結果 全部患者治療后4、12周的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA均明顯下降。總有效率100%（20/20）。 結論 抗HBV-DC聯合拉米夫定和胸腺肽α1治療，可快速降低血中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，促進HBeAb的產生，提高HBeAg/HBeAb的血清學轉換率。

[關鍵詞] 樹突狀細胞；慢性乙型肝炎；乙肝疫苗

[中圖分類號] R512.62[文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）01-077-03

Preliminary clinical study of anti-HBV-DC combine lamivudine and thymosin α1 treat the HBeAg positive chronic hepatitis B patients

LIU Yong WU Bangfu HU Yuanyuan

Gastroenterology and Hepatology Center, Southern Medical University Renkang Hospital, Dongguan 523952, China

[Abstract] Objective To observe the clinical treatment effects of the HBsAg pulsed autologous dendritic cells derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) combine lamivudine and Thymosin-α1 for the HBeAg positive chronic hepatitis B patients. Methods Twenty patients with HBeAg positive CHB accepted by clinical research. Taking peripheral venous blood 50mL, by density gradient centrifugation and adhesion method to obtain PBMC, GM-CSF and IL-4 induced expansion of DC. At the sixth days, a 30 μg HBsAg was give to pulse the DC. At the seventh days, the anti-HBV-DCs. All patients were Lamivudine dosed every day, and were injected thymosin-α1 by subcutaneous, The HBVM, HBV-DNA and liver function were respectively detected at 0,4,12 weeks. Results At 0,4,12 weeks, the serum HBsAg levels, the serum HBeAg levels and the serum HBV-DNA levels were significantly decreased.The total effective rate was 100% (20/20). Conclusion The anti-HBV-DC by subcutaneous and intravenous injection combine lamivudine and Thymosin-α1 can decrease rapid the serum HBsAg, HBeAg and HBV-DNA levels, promote to the HBeAb production, and enhance the HBeAg/HBeAb seroconversion rate.

[Key words] Pulsed autologous dendritic cells; HBsAg; Hepatitis B vaccine

機體免疫系統對HBV產生免疫耐受是人感染HBV后慢性化的主要原因。形成免疫耐受的原因可能有多種因素參與，而樹突狀細胞的功能缺陷是形成免疫耐受的重要原因之一。以HBsAg致敏自體外周血單個核細胞來源的DC治療慢性HBV感染者已取得一定的效果。我們前期的臨床研究也證實[1]，負載HBsAg的抗HBV-DC可以快速降低或清除慢性HBV感染者的病毒抗原，促進HBeAb的產生，加速HBeAg/HBeAb的血清學轉換。但是，在抑制病毒復制和減少病毒載量方面相對緩慢。目前廣泛使用的核苷類抗病毒藥物可以快速抑制HBV復制和降低病毒載量，但在降低或清除病毒抗原、促進HBeAb的產生和促進HBeAg/HBeAb的血清學轉換方面較緩慢。胸腺肽α1具有增強非特異性免疫功能，是目前唯一被推薦用于慢乙肝治療的免疫調節類藥物，但是單獨應用的療效較差。為提高以抗HBV-DC為主的免疫治療方法的臨床效果，我們在應用抗HBV-DC治療的同時，聯合應用拉米夫定和胸腺肽α1治療HBeAg陽性CHB患者，取得了較好的效果，現報道如下。

1材料與方法

1.1 研究對象

根據2000年9月西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》和2005年12月制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的標準，隨機選取南方醫科大學仁康醫院2010年6～12月住院的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者20例，其中男15例，女5例，年齡15～45歲，平均30歲。病程1～20年，均為輕度的慢性乙型肝炎患者。ALT：（46～276） U/L，ALT≤2倍正常值者11例，ALT＞2倍者9例，平均101.85 U/L。1例為HBsAg、HBeAg及HBV-DNA陽性；19例為HBsAg、HBeAg、HBcAb及HBV-DNA陽性，其中1例合并丁型肝炎病毒（HDV）感染，HDV-IgM和HDV-RNA陽性。

試驗符合南方醫科大學仁康醫院人體臨床試驗倫理學標準，并得到醫院倫理委員會的批準。試驗開始前所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 抗HBV-DC培養方法

取患者肝素抗凝的外周靜脈血50 mL，以密度梯度離心及貼壁法獲得單個核細胞。在37 ℃、5%CO2濃度的條件下，用含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素4等細胞因子的RPMI1640培養基誘導PBMC中的貼壁細胞，擴增出DC。于培養第6天給予含有30 μg HBsAg的商用乙型肝炎疫苗致敏DC，使其成為具有特異性治療CHB的DC疫苗，簡稱抗HBV-DC；于培養第7天收獲DC，并以生理鹽水洗滌2次，獲得（0.5～1.0）×106的抗HBV-DC，以2 mL生理鹽水懸浮備用。

1.3 治療方案

將以2 mL生理鹽水懸浮的抗HBV-DC皮下和靜脈各注射1 mL，每2周1次，共6次。拉米夫定（安徽貝克，批號：101102）100 mg/日，口服。胸腺肽a1（海南中和，批號：H20051916）1.6 mg皮下注射，每周2次，共24次。所有患者均不使用降酶藥物。

1.4 標本檢測

于治療開始的0、4、12周，即抗HBV-DC回輸前、回輸2次和6次后的第14天，分別以時間分辨熒光免疫分析技術（TRFIA）檢測HBV標志物（HBVM）定量，以熒光定量PCR檢測HBV-DNA定量，同時檢測ALT及總膽紅素（TBIL）等肝功能指標。

1.5 統計學處理

采用治療前后自身對照，以SPSS15.0進行統計學處理。數據以（χ±s）表示，差異顯著性檢驗采用配對樣本t檢驗，確定當P＜0.05時有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前后HBVM及HBV-DNA定量改變

所有患者在治療4周和12周時的血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平均較治療前明顯下降。4周時，HBsAg平均下降65.83%，無HBsAg轉陰；HBeAg平均下降78.95%，其中7例HBeAg轉陰（35%），但這7例中有1例在12周時HBeAg又轉陽；HBV-DNA平均下降2.15個對數值。12周時，HBsAg平均下降77.79%，仍無HBsAg轉陰；HBeAg平均下降83.11%，另有3例HBeAg轉陰，共有9例HBeAg轉陰（45%）；HBV-DNA平均下降2.26個對數值。

4周時，有12例HBeAb較治療前升高，其中9例HBeAb轉陽(45%)，但這9例中有4例在12周時HBeAb又轉陰；另3例升高者中有2例在12周時HBeAb轉陽。1例4周時HBeAb下降為零，12周時又升高，但未轉陽。7例4周時HBeAb無變化，治療前后均為零，但這7例中有4例在12周時HBeAb升高，其中2例轉陽。12周時共有9例HBeAb轉陽(45%)，見表1。

2.2 應答反應

4周時，出現單項病毒學應答者14例（70%）,其中HBV-DNA轉陰11例（55%），下降3例。6例出現HBeAg/HBeAb血清學轉換，轉換率30%（6/20），1例在12周時又出現HBeAg轉陽和HBeAb轉陰。5例出現單項生化學應答，ALT恢復正常（25%）。共有17例出現部分應答（85%），無完全應答者。

12周時，另有4例出現單項病毒學應答者，其中HBV-DNA轉陰和下降各2例，18例出現單項病毒學應答者（90%），其中HBV-DNA轉陰13例（65%）。另有4例出現HBeAg/HBeAb血清學轉換，9例出現HBeAg/HBeAb血清學轉換，總的轉換率為45%（9/20）。另5例出現單項生化學應答，ALT恢復正常，10例ALT恢復正常（50%）。12周時7例出現完全應答（35%），13例出現部分應答（65%），總應答率（有效率）為100%（20/20）。

2.3 肝功能改變與應答的關系

治療4周時，17例ALT較前下降，其中5例ALT降至正常。3例較前升高，但12周時下降。治療12周時，所有患者的ALT均較治療前下降，其中10例ALT降至正常。

4周時出現HBeAg/HBeAb血清學轉換的6例中，2例治療前ALT＞2倍正常值，4例ALT≤2倍正常值，但是，這4例中1例在12周時再轉為HBeAg陽性和HBeAb陰性。12周時達到HBeAg/HBeAb血清學轉換的9例中，5例治療前ALT＞2倍正常值，占ALT＞2倍正常值患者的55.56%（5/9）；4例ALT≤2倍正常值，占ALT≤2倍正常值患者的36.36%（4/11）。

2.4 不良反應

抗HBV-DC皮下注射后2例次出現注射部位的皮膚紅腫，未做特殊處理，數日后自行消退。抗HBV-DC注射后4例次出現頭痛和輕、中度發熱，均未做任何處理，次日消退。總的不良反應率為5%。沒有患者因為不能耐受的不良反應而停止治療。

3 討論

已知的樹突狀細胞（DC）是人體最強的抗原呈遞細胞，它專職負責攝取、加工、處理及傳遞病原微生物及癌變細胞等非己抗原的信息給下一級免疫細胞，啟動機體的抗感染及抗腫瘤免疫，因此，DC是機體抗感染及抗腫瘤的免疫啟動者。國內外大量的基礎研究表明，乙肝的慢性化與人體的免疫系統對乙肝病毒發生免疫耐受有關[3]，而免疫耐受主要原因是慢性乙肝病毒的DC功能低下，主要表現為不成熟，不能有效地將乙肝病毒感染的信息傳遞給T淋巴細胞，也不能有效地為T淋巴細胞的活化提供刺激信號，使免疫系統不能產生特異性地細胞毒性T淋巴細胞和特異性抗體來清除乙肝病毒，導致乙肝的慢性化。通過體外培養技術，可以獲得大量活化、功能基本正常并攜帶乙肝病毒抗原信息的DC。將其回輸后可以使免疫系統重新恢復對乙肝病毒的免疫識別，安全或者部分打破免疫耐受，重啟抗乙肝病毒的免疫反應

人體臨床實驗表明：以HBsAg致敏慢性HBV感染者PBMC來源自體DC細胞，將該DC回輸患者，顯示能夠抑制HBV的復制[4]，部分患者HBV-DNA、HBsAg及HBeAg轉陰。早期臨床研究顯示[6]，體外誘導擴增慢性HBV感染者自身PBMC來源的DC并經HBsAg致敏后使其成為具有特異性治療慢性HBV感染的抗HBV-DC，將其靜脈回輸，可有效地抑制慢性HBV感染者的病毒復制，減少病毒載量，顯著降低或者清除病毒HBsAg和HBeAg，促進HBeAb產生，促進HBeAg/HBeAb的血清學轉換，部分乙肝患者徹底治愈。慢性乙型肝炎HBeAg陽性患者可對抗HBV-DC的治療發生良好的應答反應[6]，是一種安全有效的治療慢性HBV感染者的免疫學治療方法，顯示出良好的應用前景。將抗HBV-DC回輸技術與核苷類似物和胸腺肽α1等藥物聯合應用[7]，發現可以進一步提高療效，明顯高于單純藥物治療的療效。

[參考文獻]

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（收稿日期：2011-10-21）