棉花無菌苗培養條件的探討

張福麗,葛紅蓮,紀瑞杰,黃云云

摘要：以棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）種子為試驗材料，對無菌苗培養前種子消毒和接種的最佳條件進行了研究。結果表明，棉花種子消毒的最佳條件為１.0 ｇ／Ｌ升汞消毒５ ｍｉｎ或５０.0 ｇ／Ｌ次氯酸鈉消毒１５ ｍｉｎ，無菌水沖洗５～６次，無菌水浸泡２４ ｈ，倒掉瓶中的無菌水后換上新的無菌水繼續浸泡至種子露白約３～４ ｍｍ，手捏種子的子葉端擠掉種皮，胚根端接觸培養基的方式接種至ＭＳ基本培養基。

關鍵詞：棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）；無菌苗；培養

中圖分類號：Ｓ５６２；Ｓ３５１．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0887-03

Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ on Ａｓｅｐｔｉｃ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ

ＺＨＡＮＧ Ｆｕ－ｌｉ，ＧＥ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎ，ＪＩ Ｒｕｉ－ｊｉｅ，ＨＵＡＮＧ Ｙｕｎ－ｙｕｎ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｋｏｕ ４６６００0，Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｅｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ａｓｅｐｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ using ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄｓ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ sterilizing ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄ ｗｅｒｅ soaking for ５ ｍｉｎ in １ ｇ／Ｌ ＨｇＣｌ２ ｏｒ １５ ｍｉｎ in ５０ ｇ／Ｌ ＮａＣlＯ， washing for ５~６ ｔｉｍｅｓ ｗｉｔｈ ａｓｅｐｔｉｃ ｗａｔｅｒ， soaking ｉｎ ａｓｅｐｔｉｃ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ２４ ｈ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒeplacing ｎｅｗ ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ ｔｏ ｓｏａｋ ｓｅｅｄ ｕｎｔｉｌ ｓｅｅｄ ｂｕｄｄｉｎｇ to ａｂｏｕｔ ３~４ ｍｍ， squeezing the ｓｅｅｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｅｎｄ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｃｏａｔ， ａｎｄ inoculating ｏｎ ＭＳ ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）； ａｓｅｐｔｉｃ； ｃｕｌｔｕｒｅ

棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）是我國重要的經濟作物，通過轉基因手段進行遺傳改良是獲得優良棉花品種的有效方法之一。在其轉化研究中，如何獲取健壯無菌苗作為外植體建立組織培養的高頻再生體系，是有效開展此項工作的前提和基礎。因此，在無菌苗培養時，種子消毒以及接種等環節就顯得相當重要。對前者而言，不僅要求消毒徹底，還要使藥劑對無菌苗的傷害最低。如果無菌苗受到的傷害較大就會長勢不良，且直接影響后續的外植體的再分化及高頻再生體系的建立。在植物的無菌苗培養中，不同的植物消毒方法會有所不同［１］。對西瓜種子而言，２５０ ｍｇ／Ｌ二氧化氯與１．５ ｇ／Ｌ的升汞聯合使用，污染率最低［２］。為了建立一套高效、穩定且對無菌苗生長影響最低的無菌苗培養體系，研究了不同消毒方法對棉花無菌苗種子消毒效果及無菌苗生長的影響，探索出了高效、穩定的消毒方法，以期為改進棉花無菌苗的培育技術提供依據。

１材料與方法

１．１試驗材料

棉花種子由本實驗室保存，選子粒飽滿、顏色正常和大小基本一致的健康棉花種子為試驗材料，７５％（體積分數，下同）乙醇、１．０ ｇ／Ｌ升汞、１０％（體積分數，下同）雙氧水、１．０ ｇ／Ｌ硝酸銀和５０．０ ｇ／Ｌ次氯酸鈉４種藥品作為消毒劑。

１．２試驗方法

１．２．１無菌苗的獲得將棉花種子分成３份，一份用７５％乙醇表面預處理３ ｍｉｎ，另一份不用乙醇預處理，第三份則用乙醇表面預處理５ ｍｉｎ，然后分別用４種消毒劑進行消毒。４種消毒劑及消毒時間為：１０％雙氧水消毒３ ｈ、１．０ ｇ／Ｌ升汞消毒５ ｍｉｎ、１．０ ｇ／Ｌ硝酸銀消毒３０ ｍｉｎ和５０．０ ｇ／Ｌ次氯酸鈉消毒１５ ｍｉｎ。每個處理共９０粒種子，其中３個重復中每個重復３０粒種子。處理后的種子用無菌水沖洗６～７次后接種在高壓滅菌的ＭＳ固體培養基上，光照度為２ ０００ ｌｘ，２５ ℃溫室中培養。

１．２．２數據處理當種子胚根長到４ ｍｍ左右時視為發芽，每２４ ｈ記錄1次發芽情況，發芽結束后統計發芽起始時間、發芽率和污染率。然后對發芽率進行差異顯著性分析。

發芽率＝（Ｎ１／３０）×１００％；污染率＝（Ｎ２／９０）×１００％；單株鮮重＝每個處理無菌苗的總重量／Ｎ１，其中：Ｎ１為每個重復發芽種子的總數；Ｎ２為３個重復污染種子的總數。

２結果與分析

２．１各種處理方法對污染率、發芽速度和無菌苗長勢的影響

由表１可知，當用雙氧水、升汞和次氯酸鈉作為消毒劑時，是否用７５％乙醇處理對污染率的影響沒有差異，平均污染率為０.0%，各組合間均無差異；當用硝酸銀作為消毒劑時，乙醇預處理對污染率有影響，沒有經過乙醇預處理的平均污染率為２２．２％。因此，從平均污染率來看，７５％乙醇分別和雙氧水、升汞、硝酸銀、次氯酸鈉進行組合，以及雙氧水、次氯酸鈉和升汞單獨使用較適合棉花種子的消毒，單獨使用硝酸銀不適合棉花種子的消毒。但在試驗中發現，在無菌苗的長勢方面，乙醇預處理對無菌苗的傷害很大，經７５％乙醇處理的無菌苗的長勢比未經預處理的差，表現為生長不旺盛，且胚軸較細，易彎曲，葉片多卷曲，并且根部往往出現黃褐現象。經硝酸銀消毒的無菌苗表現出平均株高矮、生長不旺盛，且始發芽時間較其他組合遲２～３ ｄ。

在發芽速度上，硝酸銀作為消毒劑時，無論是否用７５％乙醇預處理，發芽均較其他藥劑處理的遲２～３ ｄ，雙氧水與７５％乙醇共同作用時發芽慢１ ｄ，其他組合間無明顯差異，始發芽時間全部為２ ｄ（表１）。

２．２藥劑與乙醇共同作用對發芽率的影響

方差分析結果（表２）表明，４種藥劑對發芽率的均方是８８４．３０９，Ｆ＝４０．９４３，Ｐ=0.000＜０．０５，即存在顯著性差異；乙醇預處理與否對發芽率的偏差均方是３９．８０２，Ｆ＝１．８４３，Ｐ＝０．１８０＞０．０５，即差異不顯著；４種不同的藥劑是否配用乙醇對發芽率的均方為１１．８４２，Ｆ＝０．５４８，Ｐ＝０．７６６＞０．０５，即差異不顯著。

綜合以上對平均污染率和發芽時間分析與試驗觀察發現，用雙氧水、升汞和次氯酸鈉消毒時，事前是否用乙醇處理沒有顯著差異。當用硝酸銀消毒時，是否用乙醇預處理對污染率的影響有差異，用乙醇處理能顯著減少污染率，但由于乙醇對無菌苗的傷害很大，直接降低外植體生長及進行分化的活力。因此，在進行棉花種子消毒時，不考慮使用乙醇，直接在４種藥劑中尋求最佳消毒方法。

２．３４種藥劑對發芽率的影響

４種藥劑對棉花種子發芽率影響的多重比較如表３。結果表明：在對種子發芽率的影響上，硝酸銀和升汞、雙氧水及次氯酸鈉之間差異顯著，次氯酸鈉和雙氧水之間差異顯著，次氯酸鈉和升汞、雙氧水和升汞之間差異不顯著。其中，雙氧水對發芽率的影響最小，其次是次氯酸鈉和升汞，硝酸銀的影響較大。同時由表１可知，硝酸銀進行消毒易造成污染，因此，本試驗中適合棉花種子消毒的藥劑為雙氧水、次氯酸鈉和升汞。

２．４４種藥劑對單株鮮重的影響

由圖１可知，次氯酸鈉對單株鮮重的影響最小，升汞次之，雙氧水和硝酸銀的影響較大。綜合以上分析表明，在實際應用中可以使用次氯酸鈉或升汞對棉花種子進行消毒。

３討論

消毒劑種類的使用和接種方法在健壯無菌苗的獲得中是很重要的。由于乙醇對無菌苗造成的傷害較大，因此，在對棉花種子消毒時最好不使用乙醇，用次氯酸鈉、升汞和雙氧水是比較有效的方法。但在試驗中發現，雖然雙氧水對棉花種子發芽率的影響最小，但經其消毒的種子發芽稍遲，且無菌苗長勢較次氯酸鈉和升汞的差，致使無菌苗的鮮重較低，并影響無菌苗外植體的分化能力。這可能是由于雙氧水有輕微的腐蝕性，消毒后會加大種子中的物質向外滲漏，使種子的活力降低［3-５］。硝酸銀作為消毒劑導致種子發芽慢，且對發芽率影響最大，因此不適合棉花種子消毒。雖然升汞對種子的毒性較雙氧水大，但在清洗時，對用升汞消毒的種子多洗幾次，其間并不斷慢慢搖動，可有效清除殘留的升汞。有研究表明，經１．０ ｇ／Ｌ升汞處理的種子發芽率和發芽勢均不高［６］，消毒不徹底［７］。且消毒時間過長時，會對愈傷組織的生長產生抑制作用［８］。但在試驗中發現，在用升汞進行消毒時，控制消毒時間和清洗環節可以有效克服這一缺陷，消毒５ ｍｉｎ后可以用無菌水清洗６～７次，每次堅持２ ｍｉｎ左右，其間并不時輕輕搖動，這樣處理過的種子對發芽率和發芽勢不會有影響。但是如果消毒時間過長，清洗６～７次仍然會對生長勢有影響。有研究表明，單獨使用次氯酸鈉造成了２０％左右的番茄種子污染［９］。本研究發現，５０．０ ｇ／Ｌ次氯酸鈉能有效控制棉花種子的污染，這與甘小洪等［１０］的研究結果一致，并沒有對發芽率和長勢造成明顯影響。在對種皮的處理上，消毒前去掉種皮不如消毒后種子露白時去掉種皮為好，這樣可以大大降低消毒劑對無菌苗造成的傷害，使無菌苗的長勢更加旺盛；另外，種子露白時，不去掉種皮的無菌苗的長勢不如去掉好，且易造成無菌苗高矮不齊。

在本試驗中發現種子接種在培養基中的位置對種子發芽的影響也較大。如果把棉花種子的胚根端半埋在培養基中，有些雖然能發芽，但其發芽速度較其他慢３ ｄ左右，如果胚根端埋在培養基中再多一些，種子則不能發芽。可能是因為培養基的通透性較差，使種子的呼吸受到了影響。試驗中觀察到在接種種子時，要將種子平放，并使胚根端盡量靠近培養基，但不要埋在培養基中，這樣種子發芽會更快。

參考文獻：

［１］ 杜燕，蔣海玉，劉其寧．貯存過期油菜種子消毒方法的研究［Ｊ］． 種子，２００３（２）：３９－４０．

［２］ 李敏華，張洪溢． 無籽西瓜無菌苗萌發條件的研究［Ｊ］． 海南師范學院學報（自然科學版），２００１，１４（１）：８０－８３．

［３］ 傅家瑞． 種子的活力及其生理生化基礎［Ｊ］．種子，１９８４（３）：１－５．

［４］ ＨＡＬＭＥＲ Ｐ，ＢＥＷＬＥＹ Ｊ Ｄ． Ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｓｅｅｄ ｖｉｇｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ［Ｊ］． Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ，１９８４，１２（２）：５６１－５７５．

［５］ 錢秀診，伍曉明，胡瓊，等． 貯藏時間對油菜種子生理生化性狀的影響［Ｊ］．中國油料作物學報，１９９３（３）：３０－３２．

［６］ 欒博宇，王洪君，于洪柱，等． 紫花苜蓿無菌苗培養前的種子消毒技術研究［Ｊ］．畜牧與飼料科學，２００９，３０（１０）：１７２－１７３．

［７］ 張志元，羅永蘭，官春云． 油菜種子內生菌的檢測及殺菌消毒處理方法［Ｊ］． 湖北農業科學，２００５（１）：５２－５５．

［８］ 任敬民，陳躍進，郭麗明． 臺灣青棗組織培養的消毒方法［Ｊ］． 湖北農業科學，２００４（１）：６５－６８．

［９］ 吳志剛，宋明，王志敏，等．番茄組織培養中無菌苗培養條件的優化［Ｊ］． 中國農學通報，２００６，２２（４）：３３５－３３７．

［１０］ 甘小洪，劉馨．水青樹組織培養中無菌苗培養條件的優化［Ｊ］． 亞熱帶植物科學，２００９，３８（４）：６６－６８．