血管抑素對血管內皮細胞中的VEGF表達的影響

劉子彬 劉海俊 許丹丹 封亮旗

[摘要]目的：探討不同濃度的血管抑素對血管內皮細胞中VEGF表達的影響。方法：將體外培養的人臍靜脈內皮細胞分為三組：對照組(空白組)、A組(16mg／L血管抑素組)、B組(32mg／L血管抑素組)，通過MTT、RT-PCR、Western-Bolt等方法檢測細胞內VEGF的表達情況。結果：隨著血管抑素作用時間的延長和濃度的遞增對人臍靜脈內皮細胞的抑制作用也逐漸增強，且與對照組相比差異均有顯著性意義(P<0.05)。結論：血管抑素通過抑制VEGF的表達以抑制人臍靜脈內皮細胞增殖，從而抑制血管新生。[關鍵詞]血管抑素；血管內皮細胞；血管內皮生長因子；角膜新生血管；免疫蛋白印跡技術；時間濃度依賴

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2012)07-1165-03

血管新生是導致角膜透明度下降、免疫豁免功能喪失等重要因素之一，因此，抑制角膜血管新生對于眼科尤為重要；血管新生是通過血管內皮細胞的遷移、增殖等方式實現血管生長：血管抑素是目前發現作用最強、實驗效果最好的血管生成抑制劑。本實驗觀察血管抑素對體外培養的人臍靜脈內皮細胞的抑制作用。

1材料和方法

1.1材料：Lysine-Sepharose 4B(Pharmacia公司)；彈性蛋白酶、膠原酶、十二烷基磺酸鈉、氯仿、胎牛血清、二甲基亞砜、MTT(sigma公司)；Tris堿(Promega公司)：健康新生兒臍帶由解放軍第421醫院提供；蛋白分子質量標準、胰蛋白酶(華美生物工程公司)；鹽酸賴氨酸、6-氨基己酸；小鼠抗人VEGF多克隆抗體和小鼠抗人β-actin多克隆抗體(美國BD公司)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所)；全蛋白提取試劑盒及BCA法蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基公司)；辣根酶標記抗小鼠IgG(北京中杉金橋)：血管抑素K1-4(環球碧澳公司)。

細胞總RNA提取試劑盒RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。PCR引物設計利用Primier5.0設計，由上海英駿生物技術有限公司合成引物序列VEGF引物序列(127bp)：5-TGGACCCTGGCTTTACTGCTG-3，5-GGCAATAGCTGCGCTGGTAGA-3。GAPDH引物序列(133bp)：5_GAEAACTTTGGCATCGTGGA-3，5-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3。

1.2方法

1.2.1人臍靜脈細胞培養：無菌條件下切取血管，長lOcm，直徑約大于5mm；用裝有PBSA的注射器沖洗血管標本，去除血液和凝塊：結扎一端，灌滿膠原酶溶液，結扎另一端室溫放置10min；從上端結扎處剪掉上端，收集血管內膠原酶，移入10cm培養血：用10ml PBSA沖洗內臟并收集到培養皿內的膠原酶液中；將收集到的消化液用離心法在培養液中洗2次；收集細胞，重新懸浮于培養液中，接種于鋪有明膠的培養皿或瓶中；細胞長滿后可常規胰蛋白酶消化法傳代培養。

1.2.2 MTT法測定血管抑素對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響：取3～5代人臍靜脈內皮細胞稀釋成單細胞后，接種于96孔板，每孔加入100μl，置于37℃、體積分數為0.05的CO²及飽和濕度培養箱中培養24h。當細胞形成單層細胞后棄上清，加入質量濃度為16mg／L、32mg／L血管抑素，每個質量濃度設3個復孔，對照組加入等量的含2g幾二甲基亞砜的磷酸鹽緩沖液代替(即分為三組A組：空白對照組；B組：16mg／L血管抑素組：C組：32mg／L血管抑素組)，三組均作用72h后每孔加入5mg/LMTT溶液201M繼續培養4h，棄上清，每孔加二甲基亞砜150μ1，振蕩10min后酶標儀490nm讀取吸光度值(A)(參考波長為570nm)，計算不同時間、不同質量濃度的血管抑素對人臍靜脈內皮細胞的抑制率。抑制率=(對照組A490-實驗組A490／對照組A490)×100％。

1.2.3熒光定量PCR反應：分別采用VEGF和GAPDH引物，以cDNA為模板試劑盒說明進行PCR特異性擴增，所有實驗均重復3次，取3次結果的平均值為實驗結果。

VEGF蛋白的western blot檢測收集A組、B組、C組三組細胞。根據試劑盒說明操作，行ECL化學發光法檢測，β-actin為內對照。

1.3觀察指標：血管內皮細胞在血管抑素不同濃度下的生長情況；各組血管內皮細胞中VEGF蛋白的表達含量。

1.4統計學分析：采用SPSS 13.0統計軟件包分析，所得數據以x±s表示，MTT實驗數據采用析因設計資料方差分析，QRT-PCR結果數據進行方差齊性檢驗和One way ANOVA分析；方差齊的多重比較采用LSD法，方差不齊采用DennettsT3法；雙側檢驗P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1血管抑素對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響：MTT法測定血管抑素對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響不同質量濃度的血管抑素作用于人臍靜脈內皮細胞24h后，可見空白組細胞排列緊密，增生明顯，有連成片的趨勢；A組(16mg／L組)細胞呈點片狀增生，排列疏密有致；B組(32mg/L組)細胞呈稀疏狀排列。A490吸光度值均低于對照組，對內皮細胞增殖的抑制作用隨著血管抑素濃度的增加而增加。血管抑素作用于人臍靜脈內皮細胞24，48，72h后細胞明顯受抑制，吸光度值均低于對照組。測定結果顯示：當在血管抑素濃度不變的情況下，抑制作用隨時間的延長而增強(F=493.245 P=0.000)：當血管抑素質量濃度從0，16，32mg／L逐漸加大劑量時，人臍靜脈內皮細胞的抑制作用也逐漸增強(F=1964.224 P=0.000)，72h時最大抑制率達到80.00％，且與對照組相比差異均有顯著性意義(P

2.2實時熒光定量PCR結果顯示，以2作為統計量，經方差齊性檢驗得(F=168.425 P=-0.000)，各組間比均為P=O.000，各組之間均有統計學差異。與空白對照組比較；A、B組VEGF mRNA的表達分別下降了約4096、73％。(如表1、2和圖1)

2.3血管抑素對VEGF蛋白表達的影響：Western blot結果顯示血管抑素作用人臍靜脈細胞后，三組中VEGF蛋白表達含量不同，且隨著血管抑素濃度的增加和時間延長而減少(圖2)。

3討論

血管生成是指毛細血管從血管周圍生成的過程“]，其在正常和病理情況下均能發生；血管抑素K1-4是纖溶酶原的降解片段并具有強大的抑制新生血管形成作用，可特異地抑制處于增殖狀態的血管內皮細胞并誘導內皮細胞的凋亡，來發揮強大的抑制新生血管的作用，并且不影響靜止的內皮細胞。

多項腫瘤研究報告證明，腫瘤的轉移和生長依賴于血管的形成，因此抗血管新生成為抗腫瘤的一種最為重要的治療手段。血管抑素于1994年被0Reilly等發現血以來，它以高效的抗新生血管生成作用且無耐藥性等特點而倍受關注，是當前已知最為有效的血管生成抑制劑。本實驗通過證明血管抑素是以抑制血管內皮細胞增生達到抑制血管形成，從而阻斷角膜新生血管的形成，且能有效的促進已形成的新生血管萎縮。同時也證明了新生血管的內皮細胞是血管抑素作用的直接靶點之一，對其他細胞及正常狀態下的血管內皮細胞未見明顯抑制作用。

MTT實驗結果顯示血管抑素能顯著抑制內皮細胞的生長，隨著血管抑素濃度的增加其抑制作用亦顯著增加：當血管抑素質量濃度逐漸加大時，隨著作用時間的延長對其抑制作用也逐漸增強，具有劑量一時間的雙重依賴性。國內外研究均證明了VEGF在血管新生過程起重要作用，抑制了VEGF的表達即可抑制新生血管的形成；實時熒光定量PeR結果顯示，對照組與A組中的VEGF-mRNA的表達存在顯著差異；對照組與B組比較存在顯著差異，A組與B組比較存在顯著差異。同時也顯示、與空白對照組比較A、B組VEGF mRNA的表達分別下降了約40％、73％。證明了血管抑素抑制新生血管是通過抑制VEGF的表達。Western blot結果再次證明血管抑素作用人臍靜脈內皮細胞后，VEGF蛋白表達的改變，隨著血管抑素濃度的增加和時間延長而減少。

角膜新生血管的生長亦是通過血管內皮細胞的增殖、遷移等方式實現血管新生。血管抑素通過作用VEGF靶點在體外細胞培養過程中顯示了強大的抗血管內皮細胞增殖、遷移等作用，從而抑制了新生血管的延長、甚至引起已形成的新生血管萎縮、退化。上述實驗為血管抑素在治療眼科角膜新生血管提供有力的支持。為下一步的動物實驗及臨床實驗打下基礎。