急性應激大鼠中樞色氨酸羥化酶-2表達變化☆

張盛宇* 禹順英* 汪東祥* 鄭賢杰胡淑楠李霞

·論 著·

急性應激大鼠中樞色氨酸羥化酶-2表達變化☆

張盛宇* 禹順英* 汪東祥* 鄭賢杰△胡淑楠△李霞

【摘要】目的 探討急性應激大鼠各腦區五羥色胺合成通路中色氨酸羥化酶-2（Tryptophan hydroxylase-2，TPH2）的作用機制。方法采用電擊誘導應激模型，將16只SD大鼠隨機分為實驗組與對照組，每組8只，實驗組每天上午予以40 min的電擊誘導1次持續3天，建模后采用曠場試驗評價大鼠行為；安樂處死，取血液及腦組織（海馬、前額葉、中縫核及紋狀體）低溫保存后采用采用實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）檢測外周血及各腦區的TPH2mRNA的表達。結果 經3天電擊誘導后，實驗組大鼠活動明顯減少，與對照組行為學數據有顯著性差異（P＜0.05）。實驗組海馬（0.914±0.513 vs 3.640±2.836）、中縫核（0.484±0.374 vs 2.685±2.662）TPH2mRNA表達升高（P均 ＜0.05）；外周血、前額葉、紋狀體TPH2mRNA表達兩組比較無統計學差異（P＞0.05）。結論 急性應激大鼠在中樞海馬、中縫核TPH2mRNA的表達顯著增加，前額葉、紋狀體與外周血無顯著變化。

【關鍵詞】大鼠 急性應激模型 抑郁癥 色氨酸羥化酶-2

抑郁癥是一種常見的精神疾病，據世界衛生組織、世界銀行和哈佛大學的一項聯合研究表明，到2020年單向抑郁癥將達到全球疾病負擔的第二位［1］。抑郁癥的病因學尚不明確，其中中樞五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）功能低下是抑郁癥生化機理中較公認的假說。色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）作為5-HT合成過程中的限速酶，調節5-HT的生成，是五羥色胺合成通路中非常重要的環節。TPH基因有TPH1和TPH2兩種亞型，研究發現TPH2基因僅特異地表達于中樞，腦干的TPH2mRNA水平約為TPH1mRNA的150倍，提示TPH2在中樞神經5-HT的合成中起到重要作用［2］。中樞5-HT水平受很多因素的影響，包括合成、代謝和轉運等。抑郁癥中樞5-HT水平改變是否在合成環節中受到TPH2調控并沒有明確的定論。本研究運用逆轉錄聚合酶鏈反應，檢測急性應激模型大鼠大腦海馬、前額葉、紋狀體、中縫核及外周血TPH2的mRNA表達情況，探討TPH2在抑郁癥的病理機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由華東師范大學實驗動物科學部提供，封閉群屬，清潔級，SCXK（滬）2010-0002，6～8周齡，體重200～250 g／只。

1.1.2 主要試劑 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒（美國Fermenias公司），Real-Time PCR探針，Assays ID： Rn00598017＿m1（Taqman公司設計的探針）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組 聚碳酸酯飼養籠飼養，每籠3～4只，自由攝食進水，維持周期12 h的晝夜節律（光照時間7：00～19：00 h），飼養室溫度（22±1）℃，相對濕度50%，適應飼養環境1周后開始實驗。選擇16只大鼠隨機分為實驗組與對照組，每組8只。

1.2.2 動物模型的建立 建模方法電擊誘導抑郁模型［3］，實驗組大鼠每天按編號順序依次進行一次足部電擊，足部電擊電流為0.8 mA，間歇性電擊3～6 s電擊／2～8 s非電擊，電擊總時長40 min，持續三天；對照組正常飼養三天。予以曠場試驗檢測兩組大鼠行為學指標。

1.2.3 組織取材與樣品制備 行為學測試結束后將所有大鼠后處安樂死，取血樣與腦組織，用解剖鏡在冰面上分離雙側海馬、中縫核、前額葉、紋狀體，液氮凍存，以備逆轉錄聚合酶鏈反應檢測使用。

1.2.4 基因表達的檢測 將凍存腦組織勻漿儀勻漿，血液離心后取粒細胞，加入800 μL Trizol保存，并轉移至1.5 mL EP管中，充分混勻，室溫靜置15 min。采用Trizol法提取RNA，然后用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應將mRNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）檢測外周血及各腦區的TPH2mRNA的表達。反應程序為：①預變性：50℃孵化 2 min，95℃預變性 10 min；②PCR反應：95℃變性15 s，58℃退火1 min，40個循環；③溶解曲線生成：95℃預變性1 min，55℃退火1 min，55℃退火10 s并以每循環增加0.5℃的溫度進行80個循環。使用Sequence Detector Software（SDS） version 2.1軟件 （Applied Biosystems，CA，USA）實時收集熒光信號，然后應用比較Ct值（Comparative Ct Values，△Ct）方法計算TPH2基因的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0進行統計分析。數據采用均數±標準差（±s）來描述。對所獲數據進行正態性檢驗，正態性數據采用獨立樣本t檢驗；非正態分布數據采用獨立樣本秩和檢驗。對相關分析，正態分布數據采用Pearson相關分析，偏態數據采用Spearman相關分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結果

2.1 實驗組與對照組大鼠行為學比較 大鼠曠場試驗各行為學數據呈正態分布（P＞0.05）；經3 d電擊誘導后，實驗組大鼠活動明顯減少，與對照組比較，經t檢驗，總移動距離 （t＝3.043，P＝0.009）、總移動時間（t＝3.308，P＝0.005）、頭動總距離（t＝3.930，P＝0.002）、總越限次數（t＝2.761，P＝0.015）與總轉身次數（t＝2.504，P＝0.025）差異均有統計學意義。詳見表1。

2.2 實驗組與對照組大鼠外周與中樞TPH2mRNA表達比較 TPH2mRNA在外周血、海馬、中縫核、前額葉與紋狀體中均有表達，且均可被檢測，詳見圖1。TPH2mRNA在外周血、海馬、中縫核、前額葉與紋狀體中表達檢測值均呈非正態分布（P＜0.05）。與對照組比較，經Mann-Whilney U檢驗，實驗組海馬（Z＝－2.100，P＝0.036）、中縫核TPH2mRNA表達（Z＝－1.995，P＝0.046）上升有統計學意義。前額葉（Z＝－1.279，P＝0.201）、紋狀體（Z＝－0.525，P＝0.600）及外周血（Z＝－1.314，P＝0.195）與對照駔相比差異無統計學意義。詳見表2。

2.3 實驗組大鼠行為學指標與中樞TPH2mRNA表達相關性分析 實驗組大鼠在移動總時間、移動總里程、總越限次數、頭動總距離、總轉身次數的行為學數據與外周血及大腦各區TPH2mRNA表達均無相關（相關系數r范圍－0.491到0.368，均P＞0.05）。

表1 電擊誘導后實驗組與對照組大鼠行為學比較（±s）

表1 電擊誘導后實驗組與對照組大鼠行為學比較（±s）

1）與對照組相比，經t檢驗，P＜0.052）與對照組相比，經t檢驗，P＜0.01

曠場試驗行為學指標組別實驗組對照組總移動距離（m）6.237±4.2342）12.792±4.381總移動時間 （s）87.738±53.1082）183.675±62.516總越線次數732.625±194.2611）1101.250±323.863頭動總距離（m）18.296±8.3972）36.009±9.591總轉身次數9.375±3.8151）16.000±6.436

表2 電擊誘導后對照組與實驗組大鼠TPH2 mRNA表達比較（±s）

表2 電擊誘導后對照組與實驗組大鼠TPH2 mRNA表達比較（±s）

1）與對照組相比，經Mann-whilney U檢驗，P＜0.05

TPH2mRNA表達組別實驗組對照組外周血0.508±0.510 1.043±0.787海馬3.640±2.8361）0.914±0.513中縫核2.685±2.6621）0.484±0.374前額葉1.930±1.741 1.199±1.588紋狀體1.123±0.743 1.465±0.904

圖1 大鼠TPH2mRNA值在組織中的表達經PCR擴增顯示穩定可靠

3 討論

抑郁癥被認為一種應激相關性疾病，研究發現單次和重復應激都能增加海馬5-HT的釋放和代謝［4］。本研究使用連續3 d天電擊作為應激方式，建立急性應激模型。其理論基礎為，讓動物在短時間內處于不可逃避的應激刺激，并感知到這種刺激的無法控制時，便會出現類似人類的絕望、無力、悲觀等行為學特征［5］。在經過3 d電擊刺激后，實驗組大鼠活動明顯減少，與對照組相比各項曠場試驗行為學數據都有顯著性差異，出現了“類抑郁行為”。

中樞水平5-HT合成基本上依賴TPH2的水平。TPH2的水平取決于其合成過程中基因的轉錄，蛋白的翻譯，以及酶的活性等方面。在對于各個腦區TPH2mRNA表達的檢測中發現，實驗組TPH2mRNA表達在海馬、中縫核較對照組有所增加，反應了在連續3 d的電擊誘導后，TPH2基因轉錄水平增強。國外也有文獻報道在行為絕望抑郁模型大鼠（即強迫游泳試驗）刺激后24 h大鼠中樞檢測中發現，大鼠下丘腦和杏仁核的5-HT和其代謝產物五羥色胺酸濃度顯著下降，中縫核TPH2mRNA水平上升［6］。推測TPH2mRNA表達的上升是急性應激狀態下中樞五羥色胺下降后的代償的反應。由此可以進一步推測，急性應激后5-HT水平的下降可能并不是由TPH2調控的合成通路所造成的，相反5-HT水平的下降促使了TPH2mRNA的表達，從而合成5-HT來彌補其水平的不足。另外，國內文獻報道，慢性不可預見性應激模型大鼠中樞海馬與中縫核5-HT水平及TPH2mRNA表達下降［7］。對于急、慢性抑郁模型中樞TPH2mRNA表達出現截然不同的結果，推測慢性應激模型TPH2mRNA表達下降可能是中樞5-HT下降后失代償的結果。

TPH2在中縫核5-HT神經元和外周的腸肌間神經元有顯著表達［8］。大鼠研究目前證實TPH2在腦中有特異性表達［9］。外周血TPH2與中樞TPH2有無關聯目前尚無定論。國外有研究發現TPH2基因敲除大鼠和TPH2／TPH1基因雙重敲除的大鼠中樞5-HT水平顯著下降；TPH2／TPH1基因雙重敲除的大鼠外周5-HT顯著下降，但是TPH2基因敲除大鼠外周5-HT水平無差異［10］，這提示了中樞 5-HT水平主要由TPH2調控，外周5-HT水平與TPH2無關。本研究實驗組與對照組在外周血粒細胞TPH2mRNA表達未顯示明顯差異，外周血TPH2的mRNA表達與動物的曠場行為間也未顯示相關，提示外周血粒細胞TPH2mRNA表達不能作為急性應激所致抑郁的外周生物學標記。

5-HT作為中樞一種抑制性神經遞質，參與實現多個系統的生理功能，包括情緒控制、睡眠節律、疼痛感受、食物攝取及性行為等［11］。TPH2作為5-HT合成的限速酶，其水平的變化也會影響動物的認知及行為。國外一項研究發現TPH2基因是風險選擇行為測試的一個特質因素［12］。對于小鼠實驗研究發現中樞TPH2低活性小鼠攻擊性下降，強迫游泳表現差，但在曠場試驗中無明顯變化［13］。另有研究發現雄性TPH2基因敲除小鼠在曠場試驗中移動總里程及中央區時間顯著低于對照組［14］。此外，Hiroi等人發現大鼠中鋒背核延髓背內側TPH2mRNA表達與焦慮樣行為相關［15］。本研究發現曠場試驗行為學數據與中縫核、海馬TPH2mRNA表達均無相關（均P＞0.05）。其原因可能為曠場試驗的行為學太過簡單，在今后研究中可以加入其他行為學及認知測試加以完善。

中樞5-HT水平受包括合成、代謝和轉運等多方面的影響，本研究只觀察了合成環節中TPH mRNA的變化，僅僅反映可急性大鼠中樞TPH2合成中基因轉錄的情況，但并不沒有對TPH2酶的活性進行測定，此外研究未能同步檢測中樞的5-HT及其代謝物的水平，將在以后的研究中進一步的完善。

參考文獻

［1］ 王祖承.精神病學［M］.北京人民衛生出版社，2002，2：112－125.

［2］Cote F，Thevenot E，Fligny C，et al.Disruption of the nonneuronal tph1 gene demonstrates the importance of peripheral serotonin in cardiac function［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（23）：13525－13530.

［3］Dwivedi Y，Mondal AC，Shukla PK，et al.Altered Protein Kinase A in Brain of Learned Helpless Rats： Effects of Acute and Repeated Stress［J］.Biol Psychiatry，2004，56（1）：30－40.

［4］ 周建松，曹霞，李凌江，等.重復應激對5－羥色胺耗竭大鼠海馬皮質類固醇受體表達的影響［J］.中國神經精神疾病雜志，2010，36（3）：173－175.

［5］Porsolt RD，Martin P，Lenegre A，et al.Effects of an extract of Ginkgo Biloba（EGB 761）on＂learned helplessness＂and other models of stress in rodents［J］.Pharmacol Biochem Behav，1990，36（4）：963－971.

［6］Shishkina GT， Kalinina TS， Dygalo NN， et al.Serotonergic changes produced by repeated exposure to forced swimming：correlation with behavior［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1148：148－153.

［7］ 肖愛嬌，韓志芬，黃景斌.抑郁大鼠海馬5－羥色胺含量及中縫核色氨酸羥化酶－2表達變化研究［J］.中華精神科雜志，2008，41（3）：180－183.

［8］Walther DJ，Peter JU，Bashammakh S，et al.Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoformp［J］.Science，2003，299（5603）：76.

［9］Patel PD，Pontrello C，Burke S，et al.Robust and tissue-specific expression of TPH2 versus TPH1 in rat raphe and pineal gland［J］.Biol Psychiatry，2004，55（4）：428－433.

［10］Hiroi R，McDevitt RA，Morcos PA，et al.Overexpression or knockdown of rat tryptophan hyroxylase-2 has opposing effects on anxiety behavior in an estrogen-dependent manner［J］.Neuroscience，2011，176：120－131.

［11］Kranz GS，Kasper S，Lanzenberger R.Reward and the serotonergic system［J］.Neuroscience，2010，166（4）：1023－35.

［12］Juhasz G，Downey D，Hinvest N，et al.Risk-taking behavior in a gambling task associated with variations in the tryptophan hydroxylase 2 gene：relevance to psychiatric disorders［J］.Neuropsychopharmacology，2010，35（5）：1109－1119.

［13］Osipova DV，Kulikov AV，Popova NK.C1473G polymorphism in mouse tph2 gene is linked to tryptophan hydroxylase-2 activity in the brain，intermale aggression，and depressive-like behavior in the forced swim test［J］.J Neurosci Res，2009，87（5）：1168－1174.

［14］Savelieva KV，Zhao S，Pogorelov VM，et al.Genetic disruption of both tryptophan hydroxylase genes dramatically reduces serotonin and affects behavior in models sensitive to antidepressants［J］.PLoS One，2008，3（10）：e3301.

［15］Hiroi R，McDevitt RA，Neumaier JF.Estrogen selectively increases tryptophan hydroxylase-2 mRNA expression in distinct subregions of rat midbrain raphe nucleus： association between gene expression and anxiety behavior in the open field［J］.Biol Psychiatry，2006，60（3）：288－295.

（責任編輯：文飛）

* 上海交通大學附屬精神衛生中心（上海 200030）

△華東師范大學

【中圖分類號】R749.4

【文獻標識碼】A

收稿日期：（2012－01－03）

doi：10.3969／j.issn.1002－0152.2012.08.013

項目基金☆號：國家自然科學青年基金（編號：81101007）；上海市科委醫學引導類項目 （編號：09411965600）

通訊作者（Email：ja＿1023＠yahoo.com.cn）