雙水相萃取結(jié)合液相色譜法分離蛋白質(zhì)

摘 要 建立了PEG/（NH4）2SO4雙水相體系萃取富集，結(jié)合液相色譜分離分析多種蛋白質(zhì)的方法。考察了無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)和濃度、PEG分子量、pH值和溫度等因素對(duì)雙水相形成以及對(duì)細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶分配行為的影響。結(jié)果表明，上述5種蛋白在室溫、pH 3.5～9.0范圍內(nèi)，可在15%PEG-4000/10% （NH4）2SO4雙水相體系中得到富集，且主要集中在下相。同樣條件下，血清中的高豐度蛋白在上下相均有分配，下相分配量較大。通過(guò)雙水相萃取分離蛋白質(zhì)及對(duì)液相色譜一定時(shí)間段的色譜峰收集，可初步實(shí)現(xiàn)血清中高豐度蛋白質(zhì)的分離去除。

關(guān)鍵詞 雙水相萃取； 蛋白質(zhì)分離； 血清

1 引 言

復(fù)雜生物體系中蛋白質(zhì)組分的高效分離是生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域研究和生產(chǎn)的基礎(chǔ)。鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法等傳統(tǒng)分析方法普遍存在萃取效率較低、操作步驟繁瑣、分離過(guò)程中容易發(fā)生蛋白質(zhì)變性等不足。雙水相萃取具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、易于放大、條件溫和、保持蛋白質(zhì)活性等優(yōu)勢(shì)，在生物大分子分離中得到廣泛關(guān)注^[1～5]，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中也有應(yīng)用^[6～8]。目前，雙水相萃取主要用于單一組分蛋白質(zhì)的分離富集^[9]，由于選擇性分離和檢測(cè)方法的限制，多組分蛋白質(zhì)的相關(guān)報(bào)道較少。本研究在前期工作^[10]基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了影響PEG/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系形成的因素，并結(jié)合液相色譜法研究了細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶和血清樣品在雙水相體系中的分配行為，初步實(shí)現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)的分離分級(jí)。本方法可用于血清樣品的萃取分離，是一種簡(jiǎn)便、低成本的樣品預(yù)處理方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、人血清白蛋白、聚乙二醇系列（PEG-2000 至 PEG-20000，分析純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；三氟乙酸（TFA，分析純，北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司）；Na2HPO4， NaH2PO4， （NH4）2SO4， H3PO4， H2SO4， NaOH， NaCl等均為分析純?cè)噭蝗搜鍋?lái)源于北京血液中心；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.2 色譜條件

LC-20A高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimazu公司）；Zorbax 300SB-C8反相色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 mm， 300 ，美國(guó)Agilent公司）。流動(dòng)相A：乙腈-0.1% TFA，B：水-0.1% TFA。梯度洗脫：0～30 min，30%～60% A。檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量10 L。

2.3 溶液的配制及萃取

2.3.1 儲(chǔ)備液配制 配制質(zhì)量比為40% （NH4）2SO4 溶液及5 g/L細(xì)胞色素C、溶菌酶、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、肌紅蛋白溶液，4 ℃保存。

2.3.2 雙水相蛋白質(zhì)溶液配制 依次加入0.375 g PEG， 0.625 g 40% （NH4）2SO4，分別加入100 L 細(xì)胞色素C、溶菌酶、肌紅蛋白、牛血清白蛋白溶液，5300L胰蛋白酶溶液，以去離子水定量至2.500 g。

2.3.3 雙水相血清樣品配制 依次加入0.150 g PEG， 0.250 g 40% （NH4）2SO4， 200 L血清，以去離子水定量至1.000 g。

2.3.4 血清對(duì)照樣品配制 200 L血清，以去離子水定量至1.000 g。

將上述雙水相溶液分別在4000 r/min下離心10 min，靜置分相后標(biāo)記分相界面。分別取上下兩相進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，根據(jù)蛋白質(zhì)峰面積和相比計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量。

3 結(jié)果與討論

形成穩(wěn)定的高聚物/無(wú)機(jī)鹽雙水相是蛋白質(zhì)萃取分離的基礎(chǔ)。PEG/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系中，上相為富PEG相，下相為富鹽相。無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)及濃度、PEG的分子量以及溶液溫度均影響雙水相的形成。因蛋白質(zhì)等電點(diǎn)存在差異，溶液pH值也影響雙水相的形成和蛋白質(zhì)分配。

3.1 無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)的影響?yīng)?/p>

在15% PEG^[10]條件下，考察了硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽對(duì)雙水相成相的影響。實(shí)驗(yàn)表明，PEG均可與這些無(wú)機(jī)鹽形成雙水相。因Na2HPO4-NaH2PO4和（NH4）2SO4具有成本低、用量少、溶解速度快、易成相且分相快速等優(yōu)點(diǎn)，被經(jīng)常使用。3.2 pH值的影響?yīng)?/p>

對(duì)形成的雙水相體系，調(diào)節(jié)pH值考察酸度對(duì)雙水相體系穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，PEG/Na2HPO4-NaH2PO4體系在pH 3.5時(shí)已不能形成雙水相；而PEG/（NH4）2SO4體系在pH 3.5～9.0范圍內(nèi)，雙水相體系成相穩(wěn)定，且無(wú)明顯相比變化，說(shuō)明pH值影響雙水相的穩(wěn)定性。實(shí)際分離過(guò)程中，受pH值影響小的雙水相體系更穩(wěn)定，利于樣品在雙水相中的穩(wěn)定分配，故本實(shí)驗(yàn)選用15% PEG/（NH4）2SO4雙水相體系。

3.3 （NH4）2SO4 濃度的影響?yīng)?/p>

無(wú)機(jī)鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的親疏水性和蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而影響蛋白質(zhì)在雙水相中的分配。實(shí)驗(yàn)考察了8%～20%的（NH4）2SO4對(duì)雙水相成相的影響。結(jié)果表明，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10%時(shí)，不能形成雙水相；大于18%時(shí)，則容易達(dá)到飽和出現(xiàn)析晶現(xiàn)象。（NH4）2SO4濃度在10%～18%范圍內(nèi)，隨著（NH4）2SO4濃度的增大，上相體積逐漸減小，下相體積逐漸增大，體系相比逐漸減小（圖1A）。液相色譜（圖1B和圖1C）結(jié)果表明：溶菌酶在上下兩相均有分配，其它蛋白質(zhì)則幾乎全部分配在下相（圖1D）；胰蛋白酶的響應(yīng)值很低，不能定量檢測(cè)；（NH4）2SO4濃度的增加未改變5種蛋白質(zhì)在兩相的分配趨勢(shì)。

圖1 （NH4）2SO4濃度對(duì)雙水相形成和分配的影響?yīng)?/p>

Fig．1 Effect of （NH4）2SO4 concentration on the formation of two phases and distribution of proteins

A：（NH4）2SO4濃度對(duì)兩相體積的影響；B：雙水相上相的色譜圖；C：雙水相下相的色譜圖；D （NH4）2SO4濃度對(duì)兩相蛋白質(zhì)量比的影響。15%PEG; （NH4）2SO4濃度 a: 10%; b: 12%; c: 14%; d: 16%; e: 18%；1：細(xì)胞色素C；2：溶菌酶； 3：胰蛋白酶； 4：牛血清白蛋白；5：肌紅蛋白

A: Effect of （NH4）2SO4 concentration on two phases volume; B: Chromatogram of top phase; C: Chromatogram of bottom phase; D: Effect of （NH4）2SO4 concentration on proteins distribution. PEG15%; （NH4）2SO4 concentration， a: 10%; b: 12%; c: 14%; d: 16%; e: 18%. 1: Cytochrome C （Cyt C）; 2: Lysozyme （Lys）; 3: Trypsin （Try）; 4: Bovine serum albumin; 5: Myoglobin （Myo）.

3.4 PEG分子量的影響?yīng)?/p>

高聚物PEG的分子量影響雙水相的形成。當(dāng)PEG分子量由2000增至4000時(shí)，上相體積明顯減小，下相體積相應(yīng)增加，相比急劇減小；當(dāng)PEG分子量為6000時(shí)，上下相體積接近，相比為1.04；當(dāng)PEG分子量大于6000時(shí)，相比減小的幅度趨于平緩；當(dāng)PEG分子量增至20000時(shí)，因其對(duì)上相中水分子的空間排斥顯著增大，使水分子大量轉(zhuǎn)移到下相，下相體積約增大1倍，上相體積明顯減小，雙水相體系的相比減小為0.89（圖2）。15%PEG-2000/10%（NH4）2SO4組成的雙水相中，除溶菌酶大量分配在上相，其它蛋白質(zhì)在兩相中均有分配，但以下相分配為主；PEG分子量大于4000時(shí)，蛋白質(zhì)向下相轉(zhuǎn)移，直至全部分配于下相。因15%PEG-4000/10%（NH4）2SO4形成的雙水相更穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)選為分離條件。

3.5 溫度的影響?yīng)?/p>

在4 ℃和室溫時(shí)，15% PEG-4000/10% （NH4）2SO4體系可快速形成澄清的雙水相，且相比較小；50 ℃時(shí)，成相速度減慢，體系開(kāi)始渾濁；80 ℃時(shí)，上下相分層界面不清晰，體系渾濁并有絮狀物析出。由于PEG在水中的溶解度受溫度的影響較大，雙水相體系形成明顯受溫度影響；蛋白質(zhì)在上下相的質(zhì)量比隨溫度增高而降低，即蛋白質(zhì)由上相向下相轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)選用室溫對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行萃取分離。

3.6 NaCl對(duì)成相和蛋白分配的影響?yīng)?/p>

由3.3可知，15% PEG與8% （NH4）2SO4不能形成雙水相。但向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～9% NaCl后，下相的體積逐漸增加，出現(xiàn)明顯的相界面；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～15%時(shí)，體系出現(xiàn)渾濁，分相速度減緩。以上結(jié)果說(shuō)明，NaCl與（NH4）2SO4作用相似，可加快分相。液相色譜檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～6%時(shí)，溶菌酶向上相轉(zhuǎn)移；細(xì)胞色素C、肌紅蛋白和牛血清白蛋白則向下相轉(zhuǎn)移。由于Na＋和Cl－在兩相間存在分配系數(shù)差異，加入NaCl可能導(dǎo)致兩相間較大的電位差。 圖2 PEG分子量對(duì)成相的影響?yīng)?/p>

Fig．2 Effect of polyethylele glycol （PEG） molecular weight on the formation of two phases因此，加入NaCl可降低PEG/（NH4）2SO4體系成相所需的（NH4）2SO4濃度，加快成相速度；同時(shí)改變體系的離子強(qiáng)度和相間電位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分配發(fā)生變化。

3.7 血清樣品中白蛋白的分離

白蛋白占血清總蛋白含量50%以上，是高豐度蛋白。將人血清樣品經(jīng)15% PEG-4000/10% （NH4）2SO4雙水相分離，液相色譜檢測(cè)結(jié)果表明：蛋白質(zhì)在上下兩相均有分配，但在下相的分配量明顯高于上相（圖3a和圖3b），而血清對(duì)照樣品則無(wú)明顯的蛋白峰（圖3c），即15% PEG-4000/10% （NH4）2SO4體系對(duì)血清蛋白有明顯的分離富集作用。

收集色譜圖中不同時(shí)間段的樣品，對(duì)血清中的高豐度蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。按色譜時(shí)間（Ⅰ: 8～12 min；Ⅱ: 12～16 min；Ⅲ: 16～20 min）對(duì)下相樣品進(jìn)行分段收集、冷凍干燥，溶解后進(jìn)行液相色譜分析。結(jié)果表明：第Ⅰ和Ⅲ段樣品均無(wú)明顯色譜峰（圖4a和4c）；第Ⅱ段樣品出現(xiàn)明顯色譜峰，且稀釋至原下相體積3倍后（圖4b）所得峰面積值約為原下相色譜峰面積（圖4d）的1/3。凝膠電泳分析結(jié)果表明，該下相含有人血清白蛋白（圖5），說(shuō)明分配在下相中的人血清白蛋白可以被完整收集并去除。同法也可對(duì)上相進(jìn)行分段收集，實(shí)現(xiàn)上下相中血清中高豐度蛋白的分離去除。

4 結(jié) 論

雙水相萃取可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的選擇性分配，其富集作用可使高豐度和低豐度蛋白得到預(yù)分離。利用蛋白質(zhì)在穩(wěn)定雙水相體系中分配行為的差異，結(jié)合液相色譜法確定分段收集時(shí)間，可以初步實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中特定蛋白質(zhì)組分的分離和去除。同時(shí)，高選擇性雙水相體系的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化，有望解決復(fù)雜體系中目標(biāo)分子的選擇性分離和富集的問(wèn)題。

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Separation of Proteins by Aqueous Two-phase Extraction

System Combined with Liquid Chromatography

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ZHAO Xin-Ying1，2， QU Feng1， DONG Min1， CHEN Fan1， LUO Ai-Qin1， ZHANG Jing-Hua2

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1（School of Life Science and Technology， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081）

2（Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089）

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Abstract A combination of aqueous two-phase extraction system （ATPS） of polyethylene glycol （PEG）/（NH4）2SO4 with high performance liquid chromatography （HPLC） was proposed for enrichment and separation of proteins. The effects of inorganic salt， concentration， PEG molecular weight， pH， temperature and NaCl on the formation of two phases and partition of cytochrome C， lysozyme， trypsin， bovine serum albumin and myoglobin were investigated， respectively. The results showed that five proteins were enriched mainly in bottom phase in 15% PEG-4000/10% （NH4）2SO4 solution at room temperature and pH range from 3.5 to 9.0. High abundance proteins in serum also distributed in two phases and the bottom phase had larger amount at the same conditions， which could be extracted and separated by optimized ATPS. The proteins were collected based on their retention time in HPLC， and could be removed from serum samples. Keywords Aqueous two-phase extraction; Proteins separation; Serum

（Received 23 June 2011， received 29 July 2011）