響應(yīng)范圍可調(diào)的 pH 熒光傳感器的構(gòu)建及其性能研究

摘 要 合成并表征了化合物N，N′二谷氨酸銨鹽3，4，9，10苝四羧酸二酰亞胺（PTCDG）。此化合物水溶性好，熒光量子產(chǎn)率高?；诖?，設(shè)計(jì)了一組新穎的響應(yīng)范圍可調(diào)的pH熒光傳感器。PTCDG與順磁性的Fe3＋可按1∶1絡(luò)合，絡(luò)合常數(shù)為6.5×105，考察了其它金屬離子的影響，表明PTCDG對(duì)Fe3＋有良好的選擇性。PTCDG與Fe3＋結(jié)合后，由于PET效應(yīng)，熒光猝滅，伴隨pH值增大，F(xiàn)e3＋與OH－形成Fe（OH）3，從體系中沉淀出來(lái)，熒光團(tuán)被釋放，從而熒光恢復(fù)。在不同的Fe3＋的良好配體存在條件下，形成Fe（OH）3的pH范圍向堿性方向移動(dòng)。PTCDG， PTCDG/Fe3＋， PTCDG/Fe3＋/三乙胺， PTCDG/Fe3＋/吡啶、PTCDG/Fe3＋/鄰菲羅啉的響應(yīng)范圍分別為4.0～6.0， 5.0～10， 5.0～7.0， 6.0～8.0和7.0～9.0，涵蓋了pH值4.0～10的區(qū)間，實(shí)現(xiàn)了響應(yīng)范圍的可調(diào)。考察了內(nèi)在的干擾物對(duì)該傳感器的效能的影響，探討了此體系的熒光傳感機(jī)理。此傳感器具有很多優(yōu)異的性能，響應(yīng)的范圍可調(diào)且近中性，熒光和顏色變化明顯，響應(yīng)快，具有較高的靈敏性。

關(guān)鍵詞 苝二酰亞胺；水溶性；pH熒光傳感器；吸收光譜；熒光光譜

1 引 言

近年來(lái)，pH熒光傳感器為研究pH值變化對(duì)生理活動(dòng)的影響提供了強(qiáng)有力的探測(cè)工具，廣泛地用于分析化學(xué)、生物分析化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)（量度細(xì)胞內(nèi)的pH值）和醫(yī)學(xué)（監(jiān)控血液中的pH值）等領(lǐng)域^[1，2]。苝及其衍生物具有優(yōu)異的化學(xué)、熱和光化學(xué)穩(wěn)定性^[3，4]，對(duì)從可見(jiàn)區(qū)到紅外區(qū)的光有很強(qiáng)的吸收，而且其熒光量子產(chǎn)率接近1，單線態(tài)的熒光壽命大約為4 ns^[5]，在分子電子學(xué)材料、激光材料、液晶顯示材料、電致發(fā)光器件、感光體及太陽(yáng)能電池方面有著廣泛的應(yīng)用^[6]，是一類性能優(yōu)異的分子熒光探針^[7]。

帶有羧基的苝酰亞胺型熒光染料具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：苝骨架使其具備親脂性；羧基兼具親水性，使其能滲透到細(xì)胞內(nèi)，可用于活體組織內(nèi)pH值的測(cè)定；斯托克斯位移較大可避免吸收光譜干擾發(fā)射光譜，從而提高測(cè)試的靈敏度與準(zhǔn)確性^[8]。因此將帶有胺基的苝酰亞胺類熒光染料開(kāi)發(fā)作為pH熒光探針具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)合成了含有4個(gè)羧基親水性基團(tuán)的苝二酰亞胺衍生物（分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），基于此化合物，設(shè)計(jì)了一種響應(yīng)區(qū)間可調(diào)節(jié)的pH熒光傳感器。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Inova 400 MHz核磁共振氫譜儀、CARY50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安公司）； TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)布魯克光譜儀器公司）； F4500型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）； PHS3C精密pH計(jì)（上海雷磁公司）。

苝四酸酐與谷氨酸鈉（分析純，Aldrich公司）；KOH、二甲基亞砜、濃H2SO4、無(wú)水乙醇、NaOH、HCl等均為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 N，N′二谷氨酸銨3，4，9，10苝四羧酸二酰亞胺（PTCDG）的合成^[9，10]

PTCDG的合成路線如圖1所示。首先合成N，N′二谷氨酸基3，4，9，10苝四羧酸二酰亞胺（化合物2）。稱取0.8 g精制的苝四酸酐和5.0 g谷氨酸鈉超聲分散在80 mL二甲基亞砜中，加熱回流，每隔30 min取少量樣品在濃H2SO4中測(cè)定其紫外可見(jiàn)吸收光譜，直到在500和546 nm處苝四酸酐的特征吸收峰消失，560和600 nm處出現(xiàn)對(duì)稱苝四羧酸二酰亞胺的特征峰，且560和600nm特征峰的相對(duì)強(qiáng)度基本不變時(shí)，停止反應(yīng)。將反應(yīng)后的體系離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗至濾液基本無(wú)色，加水，用稀HCl酸化至pH 1，水洗3次，得化合物2。

mol/L，F(xiàn)eCl3濃度為10 mmol/L，配體濃度1.0 mmol/L。用KOH或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0或0.1 mol/L）滴定。直到 pH＞10或pH＜5。每次滴定結(jié)束，以λex＝533 nm測(cè)其熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 PTCDG的UVvis吸收光譜

PTCDG是一種弱酸弱堿鹽，幾乎呈中性，其在寬 pH 范圍內(nèi)顯示了高度的穩(wěn)定性和水溶性。其水溶液中的吸收在400～600 nm 之間，最大吸收波長(zhǎng)為533 nm。

對(duì)于苝系衍生物而言，電子振動(dòng)吸收具有自身的特點(diǎn)，電子振動(dòng)能級(jí)存在從υ＝0 到υ′＝0， 1和2的躍遷（υ和υ′分別對(duì)應(yīng)于基態(tài)和激發(fā)態(tài)）。在自由單體狀態(tài)下，傅蘭克康頓（FranckCondon）效應(yīng)系數(shù)為A0→0 ＞ A0→1＞ A0→2；當(dāng)單體開(kāi)始聚集時(shí)，電子從0→1和0→2躍遷的幾率會(huì)增加^[11，12]。將其進(jìn)行歸一化，如圖2所示，從pH 9.87到pH 4.73，0→1與0→0相比躍遷的幾率變化不大，說(shuō)明在這個(gè)pH范圍，苝四羧酸根以單體形式存在，ππ聚集作用非常弱；當(dāng)pH值繼續(xù)降低到4.28，甚至是更低時(shí)，0→1躍遷吸收發(fā)生明顯增大。初始的吸收峰發(fā)生紅移，最終在整個(gè)檢測(cè)波段內(nèi)出現(xiàn)吸收。此結(jié)果說(shuō)明，PTCDG在低pH值時(shí)發(fā)生了聚集， 從而阻止了光的透射；在高pH值時(shí)，PTCDG以羧酸根形式存在，苝核平面的高的負(fù)電勢(shì)防止了它的聚集， 從而獲得高的水溶性。隨著pH值降低，越來(lái)越多的羧酸根負(fù)離子變成了苝四羧酸，表面的負(fù)電勢(shì)降低，分子間的電子排斥力也降低，具有良好平面性的苝四羧酸就開(kāi)始發(fā)生ππ作用而聚集。以上結(jié)果說(shuō)明，PTCDG可以在pH＞5時(shí)穩(wěn)定存在。

3.4 響應(yīng)范圍可調(diào) pH 熒光傳感器的機(jī)理

PTCDG本身的熒光受pH值影響而變化是因?yàn)樵趬A性溶液中PTCDG以COOH－的形式存在，COOH－具有富電子特征，使整個(gè)化合物分子具有較高的電子密度，苝核平面之間存在的斥力阻止了它們的聚集從而獲得高的熒光量子產(chǎn)率。隨著COOH－不斷的質(zhì)子化，共軛體系的電子云密度不斷下降，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)減弱的趨勢(shì)，這也為吸收光譜所證實(shí)。

在PTCDG/Fe3＋體系中，PTCDG是熒光信號(hào)單元，而順磁性的Fe3＋?jiǎng)t用做OH－識(shí)別單元和熒光猝滅單元。PTCDG指示熒光開(kāi)啟狀態(tài)；在Fe3＋的存在下，COOH－與Fe3＋之間發(fā)生螯合作用，使Fe3＋與熒光指示劑結(jié)合在一起，發(fā)生了光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移，從而使PTCDG的熒光猝滅，指示熒光關(guān)閉的狀態(tài)，引入PTCDG濃度10倍的Fe3＋確保了PTCDG的熒光被完全猝滅；隨著pH的升高，OH－濃度變大，順磁性的金屬離子形成了Fe（OH）3沉淀，熒光團(tuán)被釋放出來(lái)，熒光恢復(fù)，指示熒光開(kāi)啟狀態(tài)。因COOH－與Fe3＋之間較強(qiáng)的作用力，使OH－與Fe3＋結(jié)合的阻力增大，使pH響應(yīng)范圍向高 pH 方向移動(dòng)了將近1.5個(gè)pH單位。

存在其它配體時(shí)，可形成PTCDG/Fe3＋/配體的三重復(fù)合結(jié)構(gòu)。Fe3＋因受PTCDG和配體作用的雙重影響，OH－與Fe3＋結(jié)合的阻力更大，在反應(yīng)過(guò)程中，OH－與Fe3＋結(jié)合需要克服更高的能量，因此，與在PTCDG/Fe3＋中的Fe3＋相比，后者中的Fe3＋需要在更高的pH 條件下被OH－沉淀出來(lái)（圖7）。配體的 pH 的調(diào)節(jié)作用可歸因于它們與 Fe3＋之間不同的配位能力，三乙胺由于3個(gè)乙基的保護(hù)作用，與 Fe3＋的配位作用最弱，所以在 pH 響應(yīng)范圍上僅比沒(méi)有配體的情況有很小的移動(dòng)。而吡啶的配位能力比三乙胺要強(qiáng)，響應(yīng)曲線向高 pH 方向移動(dòng)了約1個(gè)單位，進(jìn)入了對(duì)生物體系有重要意義的中性 pH 范圍。鄰菲羅啉是一個(gè)雙齒配體，與 Fe3＋的配位能力在三者中最強(qiáng)，需要在更高的pH 環(huán)境下將Fe3＋沉淀出來(lái)，所以使得 pH 的響應(yīng)范圍進(jìn)入弱堿范圍，這樣就實(shí)現(xiàn)了響應(yīng)范圍的可調(diào)節(jié)性。

圖7 pH熒光傳感器的示意圖

Fig．7 Diagram of pH fluorescence sensor

3.5 pH熒光傳感器的應(yīng)用

PTCDG/Fe3＋/吡啶體系可以在pH 6.0～8.0非常窄的范圍內(nèi)發(fā)生明顯的變化，而pH值在6.0～8.0之間的近中性的響應(yīng)范圍對(duì)于生物體系有著非常重要的意義。據(jù)此，利用PTCDG/Fe3＋/吡啶體系構(gòu)建了pH熒光傳感器。如圖8所示，在pH＝8.0的水溶液中，熒光“開(kāi)”；在pH＝6.0的水溶液中，熒光“關(guān)”。該體系的熒光強(qiáng)度變化大，熒光開(kāi)啟時(shí)的強(qiáng)度大約是熒光關(guān)閉時(shí)強(qiáng)度的30倍以上。這個(gè)過(guò)程可以很明顯用肉眼觀測(cè)到。插圖顯示了這兩個(gè)狀態(tài)的明顯差別，一個(gè)有強(qiáng)的黃色熒光，另外一個(gè)幾乎沒(méi)有熒光。

實(shí)驗(yàn)了5次pH值在6.0與8.0之間的可逆調(diào)節(jié)，如圖9所示，當(dāng)pH值在6.0與8.0之間進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)，熒光強(qiáng)度發(fā)生了可逆的變化，而且每次調(diào)節(jié)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度幾乎都可以回到原來(lái)的位置，而且是在瞬間實(shí)現(xiàn)了熒光的開(kāi)啟和關(guān)閉。

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Synthesis and Characterization of a pH Fluorescence

Sensor with Tunable Response Range

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MA YongShan*1， ZHANG FengXia2， LI PeiGang1， WU JunSen1， REN HuiXue1

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1（School of Municipal and Environmental Engineering， Shandong Jianzhu University， Jinan 250101）

2（Shandong Provincial Key Laboratory of Metrology and Measurement，

Shandong Institute of Metrology， Jinan 250014）

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Abstract N，N′bi（Lglutamic amine）perylene3，4;9，10dicarboxylic diimide（PTCDG）was synthesized and characterized. The compound abovementioned was watersoluble and had high fluorescent quantum yield. A set of novel fluorescent pH sensors with tunable response range were designed based on the PTCDG， which could react with paramagnetic Fe3＋ to form a 1:1 complex. The association constant was 6.5×105. The effects of foreign ions were examined and it was shown that PTCDG has a good selectivity to Fe3＋. The PTCDG could coordinate the paramagnetic Fe3＋ ions to switch off itself by PET quenching and could release Fe3＋ to turn on the fluorescence again by forming Fe（OH）3 as the pH increase. Moreover， under the conditions of different good ligands for Fe3＋， the formation of Fe（OH）3 moves to the alkaline pH range direction. The tunable response pH range covers 4.0－10.0 （4.0－6.0 for PTCDG， 5.0－10.0 for PTCDG/Fe3＋， 5.0－7.0 for PTCDG/Fe3＋/triethylamine， 6.0－8.0 for PTCDG/Fe3＋/pyridine， 7.0－9.0 for PTCDG/Fe3＋/phenanthroline）. The effects of the internal interference were investigated and the pH sensing mechanism was also discussed. The pH sensor had many excellent properties， such as tunable response range including the nearly neutral environment， obvious change of fluorescence and color， fast response and high sensitivity.

Keywords Perylene diimide derivative; Watersoluble; pH probe; Absorption spectrum; Flourescence spectrum

（Received 15 April 2011; accepted 24 July 2011）