響應范圍可調的 pH 熒光傳感器的構建及其性能研究

摘 要 合成并表征了化合物N，N′二谷氨酸銨鹽3，4，9，10苝四羧酸二酰亞胺（PTCDG）。此化合物水溶性好，熒光量子產率高?；诖?，設計了一組新穎的響應范圍可調的pH熒光傳感器。PTCDG與順磁性的Fe3＋可按1∶1絡合，絡合常數為6.5×105，考察了其它金屬離子的影響，表明PTCDG對Fe3＋有良好的選擇性。PTCDG與Fe3＋結合后，由于PET效應，熒光猝滅，伴隨pH值增大，Fe3＋與OH－形成Fe（OH）3，從體系中沉淀出來，熒光團被釋放，從而熒光恢復。在不同的Fe3＋的良好配體存在條件下，形成Fe（OH）3的pH范圍向堿性方向移動。PTCDG， PTCDG/Fe3＋， PTCDG/Fe3＋/三乙胺， PTCDG/Fe3＋/吡啶、PTCDG/Fe3＋/鄰菲羅啉的響應范圍分別為4.0～6.0， 5.0～10， 5.0～7.0， 6.0～8.0和7.0～9.0，涵蓋了pH值4.0～10的區間，實現了響應范圍的可調?？疾炝藘仍诘母蓴_物對該傳感器的效能的影響，探討了此體系的熒光傳感機理。此傳感器具有很多優異的性能，響應的范圍可調且近中性，熒光和顏色變化明顯，響應快，具有較高的靈敏性。

關鍵詞 苝二酰亞胺；水溶性；pH熒光傳感器；吸收光譜；熒光光譜

1 引 言

近年來，pH熒光傳感器為研究pH值變化對生理活動的影響提供了強有力的探測工具，廣泛地用于分析化學、生物分析化學、細胞生物學（量度細胞內的pH值）和醫學（監控血液中的pH值）等領域^[1，2]。苝及其衍生物具有優異的化學、熱和光化學穩定性^[3，4]，對從可見區到紅外區的光有很強的吸收，而且其熒光量子產率接近1，單線態的熒光壽命大約為4 ns^[5]，在分子電子學材料、激光材料、液晶顯示材料、電致發光器件、感光體及太陽能電池方面有著廣泛的應用^[6]，是一類性能優異的分子熒光探針^[7]。

帶有羧基的苝酰亞胺型熒光染料具有顯著的優點：苝骨架使其具備親脂性；羧基兼具親水性，使其能滲透到細胞內，可用于活體組織內pH值的測定；斯托克斯位移較大可避免吸收光譜干擾發射光譜，從而提高測試的靈敏度與準確性^[8]。因此將帶有胺基的苝酰亞胺類熒光染料開發作為pH熒光探針具有重要的應用價值和廣闊的發展前景。本實驗合成了含有4個羧基親水性基團的苝二酰亞胺衍生物（分子結構見圖1），基于此化合物，設計了一種響應區間可調節的pH熒光傳感器。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Inova 400 MHz核磁共振氫譜儀、CARY50紫外可見分光光度計（美國瓦里安公司）； TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克光譜儀器公司）； F4500型熒光分光光度計（日本日立公司）； PHS3C精密pH計（上海雷磁公司）。

苝四酸酐與谷氨酸鈉（分析純，Aldrich公司）；KOH、二甲基亞砜、濃H2SO4、無水乙醇、NaOH、HCl等均為市售分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 N，N′二谷氨酸銨3，4，9，10苝四羧酸二酰亞胺（PTCDG）的合成^[9，10]

PTCDG的合成路線如圖1所示。首先合成N，N′二谷氨酸基3，4，9，10苝四羧酸二酰亞胺（化合物2）。稱取0.8 g精制的苝四酸酐和5.0 g谷氨酸鈉超聲分散在80 mL二甲基亞砜中，加熱回流，每隔30 min取少量樣品在濃H2SO4中測定其紫外可見吸收光譜，直到在500和546 nm處苝四酸酐的特征吸收峰消失，560和600 nm處出現對稱苝四羧酸二酰亞胺的特征峰，且560和600nm特征峰的相對強度基本不變時，停止反應。將反應后的體系離心，沉淀用無水乙醇洗至濾液基本無色，加水，用稀HCl酸化至pH 1，水洗3次，得化合物2。

mol/L，FeCl3濃度為10 mmol/L，配體濃度1.0 mmol/L。用KOH或HCl標準溶液（1.0或0.1 mol/L）滴定。直到 pH＞10或pH＜5。每次滴定結束，以λex＝533 nm測其熒光強度。

3 結果與討論

3.1 PTCDG的UVvis吸收光譜

PTCDG是一種弱酸弱堿鹽，幾乎呈中性，其在寬 pH 范圍內顯示了高度的穩定性和水溶性。其水溶液中的吸收在400～600 nm 之間，最大吸收波長為533 nm。

對于苝系衍生物而言，電子振動吸收具有自身的特點，電子振動能級存在從υ＝0 到υ′＝0， 1和2的躍遷（υ和υ′分別對應于基態和激發態）。在自由單體狀態下，傅蘭克康頓（FranckCondon）效應系數為A0→0 ＞ A0→1＞ A0→2；當單體開始聚集時，電子從0→1和0→2躍遷的幾率會增加^{[11，12]}。將其進行歸一化，如圖2所示，從pH 9.87到pH 4.73，0→1與0→0相比躍遷的幾率變化不大，說明在這個pH范圍，苝四羧酸根以單體形式存在，ππ聚集作用非常弱；當pH值繼續降低到4.28，甚至是更低時，0→1躍遷吸收發生明顯增大。初始的吸收峰發生紅移，最終在整個檢測波段內出現吸收。此結果說明，PTCDG在低pH值時發生了聚集， 從而阻止了光的透射；在高pH值時，PTCDG以羧酸根形式存在，苝核平面的高的負電勢防止了它的聚集， 從而獲得高的水溶性。隨著pH值降低，越來越多的羧酸根負離子變成了苝四羧酸，表面的負電勢降低，分子間的電子排斥力也降低，具有良好平面性的苝四羧酸就開始發生ππ作用而聚集。以上結果說明，PTCDG可以在pH＞5時穩定存在。

3.4 響應范圍可調 pH 熒光傳感器的機理

PTCDG本身的熒光受pH值影響而變化是因為在堿性溶液中PTCDG以COOH－的形式存在，COOH－具有富電子特征，使整個化合物分子具有較高的電子密度，苝核平面之間存在的斥力阻止了它們的聚集從而獲得高的熒光量子產率。隨著COOH－不斷的質子化，共軛體系的電子云密度不斷下降，熒光強度呈現持續減弱的趨勢，這也為吸收光譜所證實。

在PTCDG/Fe3＋體系中，PTCDG是熒光信號單元，而順磁性的Fe3＋則用做OH－識別單元和熒光猝滅單元。PTCDG指示熒光開啟狀態；在Fe3＋的存在下，COOH－與Fe3＋之間發生螯合作用，使Fe3＋與熒光指示劑結合在一起，發生了光誘導的電子轉移，從而使PTCDG的熒光猝滅，指示熒光關閉的狀態，引入PTCDG濃度10倍的Fe3＋確保了PTCDG的熒光被完全猝滅；隨著pH的升高，OH－濃度變大，順磁性的金屬離子形成了Fe（OH）3沉淀，熒光團被釋放出來，熒光恢復，指示熒光開啟狀態。因COOH－與Fe3＋之間較強的作用力，使OH－與Fe3＋結合的阻力增大，使pH響應范圍向高 pH 方向移動了將近1.5個pH單位。

存在其它配體時，可形成PTCDG/Fe3＋/配體的三重復合結構。Fe3＋因受PTCDG和配體作用的雙重影響，OH－與Fe3＋結合的阻力更大，在反應過程中，OH－與Fe3＋結合需要克服更高的能量，因此，與在PTCDG/Fe3＋中的Fe3＋相比，后者中的Fe3＋需要在更高的pH 條件下被OH－沉淀出來（圖7）。配體的 pH 的調節作用可歸因于它們與 Fe3＋之間不同的配位能力，三乙胺由于3個乙基的保護作用，與 Fe3＋的配位作用最弱，所以在 pH 響應范圍上僅比沒有配體的情況有很小的移動。而吡啶的配位能力比三乙胺要強，響應曲線向高 pH 方向移動了約1個單位，進入了對生物體系有重要意義的中性 pH 范圍。鄰菲羅啉是一個雙齒配體，與 Fe3＋的配位能力在三者中最強，需要在更高的pH 環境下將Fe3＋沉淀出來，所以使得 pH 的響應范圍進入弱堿范圍，這樣就實現了響應范圍的可調節性。

圖7 pH熒光傳感器的示意圖

Fig．7 Diagram of pH fluorescence sensor

3.5 pH熒光傳感器的應用

PTCDG/Fe3＋/吡啶體系可以在pH 6.0～8.0非常窄的范圍內發生明顯的變化，而pH值在6.0～8.0之間的近中性的響應范圍對于生物體系有著非常重要的意義。據此，利用PTCDG/Fe3＋/吡啶體系構建了pH熒光傳感器。如圖8所示，在pH＝8.0的水溶液中，熒光“開”；在pH＝6.0的水溶液中，熒光“關”。該體系的熒光強度變化大，熒光開啟時的強度大約是熒光關閉時強度的30倍以上。這個過程可以很明顯用肉眼觀測到。插圖顯示了這兩個狀態的明顯差別，一個有強的黃色熒光，另外一個幾乎沒有熒光。

實驗了5次pH值在6.0與8.0之間的可逆調節，如圖9所示，當pH值在6.0與8.0之間進行調節時，熒光強度發生了可逆的變化，而且每次調節熒光團的熒光強度幾乎都可以回到原來的位置，而且是在瞬間實現了熒光的開啟和關閉。

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Synthesis and Characterization of a pH Fluorescence

Sensor with Tunable Response Range

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MA YongShan*1， ZHANG FengXia2， LI PeiGang1， WU JunSen1， REN HuiXue1

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1（School of Municipal and Environmental Engineering， Shandong Jianzhu University， Jinan 250101）

2（Shandong Provincial Key Laboratory of Metrology and Measurement，

Shandong Institute of Metrology， Jinan 250014）

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Abstract N，N′bi（Lglutamic amine）perylene3，4;9，10dicarboxylic diimide（PTCDG）was synthesized and characterized. The compound abovementioned was watersoluble and had high fluorescent quantum yield. A set of novel fluorescent pH sensors with tunable response range were designed based on the PTCDG， which could react with paramagnetic Fe3＋ to form a 1:1 complex. The association constant was 6.5×105. The effects of foreign ions were examined and it was shown that PTCDG has a good selectivity to Fe3＋. The PTCDG could coordinate the paramagnetic Fe3＋ ions to switch off itself by PET quenching and could release Fe3＋ to turn on the fluorescence again by forming Fe（OH）3 as the pH increase. Moreover， under the conditions of different good ligands for Fe3＋， the formation of Fe（OH）3 moves to the alkaline pH range direction. The tunable response pH range covers 4.0－10.0 （4.0－6.0 for PTCDG， 5.0－10.0 for PTCDG/Fe3＋， 5.0－7.0 for PTCDG/Fe3＋/triethylamine， 6.0－8.0 for PTCDG/Fe3＋/pyridine， 7.0－9.0 for PTCDG/Fe3＋/phenanthroline）. The effects of the internal interference were investigated and the pH sensing mechanism was also discussed. The pH sensor had many excellent properties， such as tunable response range including the nearly neutral environment， obvious change of fluorescence and color， fast response and high sensitivity.

Keywords Perylene diimide derivative; Watersoluble; pH probe; Absorption spectrum; Flourescence spectrum

（Received 15 April 2011; accepted 24 July 2011）