人肝細胞中甲基硫代砷酸的表征及其代謝過程的推測

摘 要 利用高效液相色譜電感耦合等離子體質譜（HPLCICPMS）聯用技術對染砷后Chang肝細胞中的砷代謝產物進行分析。借助合成標準， 采用標準加入法， 表征出肝細胞中一種未知砷代謝產物甲基硫代砷酸（MMTA）。定量分析顯示，MMTA含量隨染砷濃度升高呈上升趨勢。采用質量平衡分析法對雙氧水處理前后的染砷細胞樣品進行研究。結果顯示，除小分子砷代謝產物外，細胞中部分砷代謝產物以大分子形態存在，推測其為砷蛋白類物質。由于MMTA系首次在人體肝細胞中發現，本研究結合實驗現象和相關文獻推測該物質系細胞代謝產物，并且其代謝途徑與二甲基硫代砷酸相似，是以細胞內與其對應的一甲基亞砷酸為代謝起點。

關鍵詞 高效液相色譜； 電感耦合等離子體質譜； Chang肝細胞； 一甲基硫代砷酸； 一甲基亞砷酸

1 引 言

砷是人體中含量最豐富12種元素之一，同時砷也是確認的致癌毒物^[1，2]。長期接觸砷會對人體多種組織及器官造成危害，嚴重損害人類健康和勞動能力^[3]。無機砷進入機體后，主要在肝臟中發生生物甲基化，產生系列甲基化砷代謝產物^[4～6]，而這些產物的種類和毒性決定了砷的各種生物效應，因而準確分析和表征砷代謝產物是砷生物代謝研究的基礎。由于砷代謝產物的含量極低且種類較多，而與之相應的商業化的砷形態標準物質種類較少，這給砷代謝產物的表征帶來了很大的難度。

本研究組曾采用高效液相色譜電感耦合等離子體質譜（HPLCICPMS）技術對不同染砷濃度條件下Chang肝細胞中砷總量及砷代謝產物進行了研究^[7，8]。研究顯示，隨染砷濃度（三價無機砷）的增加，Chang肝細胞中砷總量和甲基砷含量呈增大趨勢，但甲基化率呈降低趨勢。此外，通過對砷代謝產物的表征，發現了兩種無法用目前已有的商業化標準表征的代謝產物，其中一種被證明為一甲基亞砷酸（MMA）。本研究采用HPLCICPMS技術對另一種未知代謝產物進行表征，并在此基礎上推測該物質的代謝過程。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

7500a型電感耦合等離子體質譜儀（ICPMS，美國Agilent公司），配Babington高鹽霧化器，雙通路霧化室；1100型高效液相色譜 （HPLC，美國Agilent公司），配二元泵及手動進樣器；Hamilton PRPX100（250 mm×4.1 mm I.D. ， 瑞士Hamilton Reno公司）陰離子交換色譜柱；Shodex Asahipak GS220 HQ 凝膠過濾色譜柱（300 mm×7.6 mm i.d.， 日本Showa Denko公司）；G1969A 飛行時間質譜（TOFMS，美國Agilent公司）；MilliQ超純水處理系統（美國Millipore公司）；AL104型電子天平（瑞士MettlerToledo公司）。

（NH4）2CO3，NH4NO3，CH3OH，Na2S，Na2SO3，KI，HCl（優級純，德國SigmaAldrich公司）；AsI3，As2O5（美國Alfa Aesar公司）；一甲基胂酸（MMA）、二甲基胂酸（DMA）購自美國Acros Organics公司；所有形態分析標準溶液均在4 ℃條件下避光保存。所有溶液均由超聲脫氣后的18.2 MΩ·cm超純水（由MilliQ超純水系統制得）配制。

2.2 細胞染砷及收集

染砷細胞樣品是本研究組與沈陽中國醫科大學合作培養獲得。以NaAsO2溶液進行染砷，染砷濃度為1.0，5.0，10和20 mol/L，培養及收集方法參見文獻\\。

2.3 一甲基亞砷酸（MMA）和一甲基硫代砷酸（MMTA）的制備

一甲基亞砷酸的制備參照文獻\\，通過二氧化硫還原一甲基砷酸制備而成。

一甲基硫代砷酸的制備參照文獻\\。采用SO2還原一甲基砷酸制備而成：在具有雙孔膠塞的錐形瓶內加入含有10 mg/L 一甲基砷酸溶液。在室溫條件下，向該溶液中通入由Na2S與HCl反應生成的H2S氣體，該過程持續1 h，至溶液充分飽和。合成過程中通過ICPMS監測MMTA的轉化情況，反應結束后利用離子色譜按照色譜方法A（表1）連續7次分離純化該標準，收集純化后的MMTA組分，于4 ℃避光保存，該標準可保存7 d。

2.4 樣品處理和HPLCICPMS及ESITOFMS分析染砷肝細胞中砷化學形態 

為保證砷在樣品中所存在形態不發生變化，細胞樣品從－70 ℃超低溫冰箱取出后吹入高純氮氣，置于4 ℃冷藏冰箱解凍，解凍后的樣品經超聲混勻，過0.45

mol/L染砷濃度的染砷細胞液時，發現細胞液中存在6種不同砷化物，通過與商業化砷形態標準物質的保留時間對比發現，其中4種砷化物可以表征出來，分別為As （tr＝188.1s），DMA （tr＝283.8 s），MMA （tr＝555.4 s） 和As （tr＝672.2 s），而對于保留時間為233.7 s的砷代謝產物，已證明為一甲基亞砷酸（MMA）^[8]。分析譜圖可知，MMA，MMA以及DMA的存在說明， Chang肝細胞攝取外源三價無機砷后進行了至少2次甲基化代謝，而細胞中As濃度遠高于As， 可能是培養過程中的外源空氣氧化導致的結果。

譜圖中保留時間tr＝840.3 s的砷代謝產物由于含量低，無法進行在線富集或直接采用HPLCESITOFMS進行分析。在文獻參閱和實驗過程中發現一些有價值的線索： Yathavakilla等^[10]采用與本實驗類似的色譜條件（相同的色譜柱和流動相）分析胡蘿卜中砷形態時發現了一種名為一甲基硫代砷酸（Monomethylthioarsonic acid，MMTA）的代謝產物。盡管樣品類別差別較大，但該物質的保留時間及峰形與本實驗中的UN峰非常相似；其次， Suzuki等^[11]在鼠體砷代謝研究中發現大量的甲基硫代砷酸類物質，并通過實驗證明甲基硫代砷酸類物質系鼠體砷代謝的產物； 第三，H2O2可以使砷化物脫掉巰基，而不影響砷化物上其它官能團^[12]。本實驗中，當在細胞樣品中加入適量H2O2反應4 h后（圖1b），細胞樣品中UN峰消失，與此對應的是一甲基砷酸（MMA）的含量成比例增加，這說明UN峰可能為一甲基砷酸的類似物。基于這些線索，初步推測UN峰可能為MMTA。

3.2 一甲基硫代砷酸（MMTA）的表征

利用ESITOFMS對合成出MMTA進行表征，經過色譜柱純化的MMTA溶于50 mmol/L （NH4）2CO3和5%甲醇混合液中，以乙酸調節至pH 7.4，以0.4 mL/min的流速直接泵入ESITOFMS中檢測。圖2a 顯示了MMTA的ESITOFMS表征結果，在合成的MMTA樣品中，產生了m/z 154.9142 \\－的分子離子峰，該分子量與理論計算得到的MMTA的理論減氫峰分子量（m/z 154.9148 \\－）的質量偏差Δm為－3.8×10－9。滿足定性分析要求。

3.3 加標法分析Chang肝細胞中的MMTA

由于Chang肝細胞中未知峰的含量非常低，無法用有機質譜直接測定其準確分子量，因而本研究采用加標法對未知砷化物進行表征。將合成后的MMTA加入細胞樣品中，采用HPLCICPMS測定細胞中加標后的砷形態，通過保留時間的一致性對未知化合物進行表征，結果見圖2。

圖2b為了采用色譜條件A，即陰離子色譜與ICPMS聯用測定加標前后細胞樣品中砷形態的譜圖。對比這兩個譜圖發現，當加入MMTA后，未知峰UN的峰面積顯著增大。通過連續測定樣品考察其保留時間發現，未知峰UN的保留時間與合成的MMTA標準的保留時間偏差為2.6%（n＝5）。

考慮到加標法表征未知化合物時，該方法無法區分一些性質相近的物質，尤其是在色譜柱上保留時間一致或相近的物質。為了排除這種影響，本研究采用小分子凝膠色譜建立了第二種色譜分離法（色譜條件B，表1）對該樣品進行重復分析，結果見圖2c。研究顯示，當采用凝膠色譜分析加標前后細胞樣品時，得到了與離子色譜相似的結果。加標后，未知峰UN的峰面積顯著增大，其保留時間與MMTA的保留時間偏差為4.3%（n＝5）。經過上述實驗，基本認定未知砷化物UN為一甲基硫代砷酸（MMTA）。 圖3 不同染砷濃度下肝細胞中砷形態譜圖

Fig．3 HPLCICPMS chromatograms obtained from arsenic species in different incubation hepatocytes

3.4 不同染砷濃度下Chang肝細胞中砷形態的質量平衡分析

不同染砷濃度下Chang肝細胞中砷形態譜圖見圖3。本研究采用質量平衡法對形態分析的準確性進行評價，結果見表2。質量平衡法是對形態分析結果進行評價的常用方法，它是根據采用形態分析方法分析出的某元素各個化學形態含量的總和應與該元素總量測定值相一致的原則來評價分析方法準確性的。細胞中砷元素的總量通過微波消解法測得。隨著染砷濃度的增加，Chang肝細胞中砷總量由18.1 g/L。說明隨著染砷濃度的提高，細胞對砷的吸收能力增強。在色譜分離的基礎上，本研究采用外標法對6種砷形態進行定量分析。通過對不同染砷濃度的Chang肝細胞中砷形態的定量分析結果發現，6種砷形態的變化趨勢與圖3得出的結論相符，證明了定量分析的準確性。對比酸消解得到的細胞中的砷總量數值與6種砷形態總和數值發現，砷形態總和的數值低于酸消解總量，這可能是由于部分砷已與蛋白結合，未在色譜分析時顯現出來。為了驗證這個假設，本研究對細胞樣品進行了H2O2氧化處理，并對處理后的樣品進行形態分析。結果顯示，雙氧水處理后的細胞樣品中砷形態的總和與酸消解總量的數值非常接近。這說明了細胞中的砷除了以小分子形式存在外，還有一部分與蛋白類物質結合。

3.5 MMTA來源的探討

盡管有報道在實驗動物的組織和尿液中發現過MMTA^[13，14]，但這種物質在人體肝細胞內被發現尚屬首次。因而有必要對其來源進行探討。目前， 關于含硫砷化物的報道多集中于二甲基硫代砷化物^[11，15]，近期的報道證明，二甲基硫代砷化物（主要是二甲基一硫代砷酸（DMMTA）和二甲基二硫代砷酸（DMDTA））是哺乳動物代謝外源無機砷的產物。而且研究顯示只有在二甲基亞砷酸（DMA）存在的情況下哺乳動物體內才可能生成DMMTA和DMDTA，二甲基砷酸（DMA）不能在生物體內生成這類含硫砷化物^[16]。此外，有研究者通過體外實驗證明，細胞中不同化學形態的DMA（包括自由態的

4 結 論

本研究利用HPLCICPMS聯用技術對Chang肝細胞中的砷代謝產物進行分析，并對其中兩種無法用已有商業化的砷形態標準確定的砷形態進行表征。結合文獻及本實驗所觀察到的現象，推測這兩種物質分別為一甲基亞砷酸（MMA）和一甲基硫代砷酸（MMTA），并通過合成標準加入法證明了該推測。此外，研究發現Chang肝細胞中砷除了以小分子形態存在外，還有一部分以大分子形態存在，推測其為砷蛋白類物質。由于MMTA系首次在人體肝細胞中發現，本研究推測該物質為細胞砷代謝的產物，并且其代謝途徑與二甲基硫代砷酸相似，以細胞內與其對應的一甲基亞砷酸為代謝起點。

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Characteristics of Arsenic Metabolites in Human Liver Hepatocytes

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CAO Xuan*1， YU JingJing2， GAO Yang1， SUN JiChang1， LIU Yan1，

XU YuanYuan3， SUN GuiFan3， WANG XiaoRu2

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1（Institute of Oceanographic Instrumentation， Shandong Academy of Sciences，

Shandong Ocean Environment Monitoring Technology Key Lab， Qingdao 266001）

2（First Institute Oceanography of State Oceanic Administration， Qingdao 266061）

3（College of Public Health， China Medical University， Shenyang 110001）

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Abstract The hyphenated technique of high performance liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry （HPLCICPMS） was applied to the determination of arsenic metabolites in Chang liver cells after arsenic incubation. Monomethylthioarsonic acid （MMTA） was characterized by standard addition method using synthesized MMTA standard. Quantitative analysis showed that MMTA was increasing when initial incubated arsenic concentration increased. The results of mass balance approach suggested that some arsenicals were found as arsenicprotein bonded forms beside low molecular arsenical forms in hepatocytes. Furthermore， MMTA， which was first found in human hepatocytes， was speculated as a kind of metabolite after arsenic incubation. Like dimethylthioarsenicals， it derived from the metabolism of MMA in human hepatocytes.

Keywords High performance liquid chromatography; Inductively coupled plasma mass spectrometry; Chang liver cells; Arsenic metabolites; Methylarsonous acid; Monomethylthioarsonic acid 

（Received 8 June 2011; accepted 8 October 2011）