壬基酚和辛基酚聯合染毒的尿液代謝組學研究

摘 要 運用代謝組學方法研究壬基酚和辛基酚聯合染毒對大鼠尿液代謝的影響。在高效液相色譜飛行時間質譜技術檢測的基礎上，通過主成分分析觀察了聯合染毒的時間毒效應和劑量毒效應。根據主成分分析和判別分析，結合t檢驗，篩選出染毒組和對照組中具有明顯差異的化合物，并在Metlin Scripps Center for Mass Spectrometry代謝物數據庫中查詢，推斷其可能的代謝標志物。結果表明，壬基酚和辛基酚聯合染毒后，尿液中可能出現的生物標志物有5種，分別為4，8二羥基喹啉2甲酸（黃尿酸）、色氨酸及N乙酰5羥色胺、RG13022和十六碳烯酸。由這些物質涉及的代謝途徑，推測壬基酚和辛基酚聯合染毒可能對生物體的蛋白質代謝、神經系統和心血管系統、生物節律、細胞抗氧化、性激素的平衡等方面產生毒效應，另外還可能影響細胞的信號傳遞和脂類代謝。

關鍵詞 壬基酚；辛基酚；代謝組學；高效液相色譜飛行時間質譜；生物標志物

1 引 言

烷基酚聚氧乙烯醚（APEs）是一種非離子表面活性劑，廣泛用于洗滌劑、除草劑、殺蟲劑、塑料添加劑、乳化劑、潤濕劑、涂料及化妝品中。此外，APEs還可用作避孕藥膏及凝膠的殺精子劑和避孕套的潤滑劑。據統計，APEs的世界年產量約為50萬噸^[1]，在各類表面活性劑中排第三，并且全球需求量還在增加。

在APEs總量中，壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol ethoxylates，NPEs）約占80%，辛基酚聚氧乙烯醚（Octylphenol ethoxylates，OPEs）約占20%^[1]。APEs類物質進入環境后經生物降解分別形成相應的烷基酚（APs），如壬基酚（Nonylphenol，NP）和辛基酚（Ocytlphenol，OP）^[2]。由于大量應用，目前NP和OP已通過廢水排放進入人類的食物鏈，在許多國家的地表水、飲用水、食品中都能檢測到NP和OP^[3，4]。

關于NP和OP的毒性研究主要集中在內分泌干擾和對生殖系統的潛在副作用方面。研究發現，NP和OP具有雌激素活性^{[5， 6]}。國外學者通過體內、體外試驗評價了烷基酚的內分泌效應，證實NP和OP能夠通過與體內雌激素受體結合，抑制或改變內源性雌激素在生殖和發育階段的功能^[7，8]。在給大鼠灌胃和皮下注射染毒兩種情況下，觀察到NP和OP的雌激素效應甚至比內分泌干擾物雙酚A還要強^[9]。關于烷基酚的代謝組學及非內分泌毒性機制研究的報道較少＋， m/z 337.2545）、羥基甲硝唑D2（\\＋， m/z 190.0791）進行保留時間及質譜強度的校正，以流動相中的酞酸酯類化合物 （\\＋， m/z 149.0233， 279.1591， 391.2843） 進行實時精確質量校正。

質譜數據用MarkView 1.2 代謝組學數據處理軟件進行峰提取、峰對齊及歸一化等處理， 之后進行主成分分析（PCA）和判別分析（DA），采用t檢驗考察不同組代謝物間差異的顯著性。

3 結果與討論

3.1 聯合染毒對大鼠產生的劑量毒性效應

連續灌胃染毒1，3，5和7 d后的尿液代謝譜數據的PCADA分析結果如圖1所示。由圖1可見，染毒1 d后，各組之間已完全分開。染毒1～7 d，

對照組各天的數據聚集在一起，高低劑量組各天的數據也分別聚在一起，且高低劑量組與對照組分別分布于不同區域，表明各組間代謝譜有明顯差別。高低劑量組與對照組在分值散點的相對位置與其劑量呈較強的對應關系。隨著染毒劑量的增加，NP和OP對大鼠的毒性增大（第一主成分的變化趨勢），表明聯合染毒對大鼠產生的毒性呈現劑量效應關系。

3.2 聯合染毒對大鼠產生的時間毒性效應

大鼠按不同劑量染毒后尿液代謝譜圖的PCADA分析結果如圖2所示。對于高劑量組，在染毒1～7 d后，染毒組與對照組內各樣本均呈聚類型分布，且各天之間均有較好的分離效果。隨著染毒時間的延長，大鼠尿液代謝譜的變化越來越明顯，表現出一定的時間軌跡。對于低劑量組，染毒各天內各樣本依然明顯聚集，而且各天之間也能明顯分離，說明低劑量染毒條件下同樣呈現出一定的時間軌跡。

圖2 ON給藥大鼠時間效應關系PCADA結果得分圖

Fig．2 Scores of PCADA with urine metabolic profiles for ON in different doses

a：高劑量組；b：低劑量組（圖中：ONL：ON低劑量組；ONH：ON高劑量組；ONLmn中，m：給藥的天數，m＝1，2，3，4分別代表給藥第1 d，第3 d，第5 d和第7 d；n： 給藥的大鼠的編號，n＝1，2，3，4，5； ONHmn同ONLmn） 

a：High dose groups; b：Low dose groups （ONL：low dose group for ON；ONH: high dose group for ON； ONLmn：Low dose ON for m days （m＝1， 2， 3， 4 represented as 1 d， 3 d， 5 d， 7 d，respectively）；n：Serial number of mouse （n＝1， 2， 3， 4， 5）；Meaning of ONHmn was the same as ONLmn）

3.3 潛在生物標志物的篩選

隨著給藥時間的延長，大鼠尿液的代謝譜也在不斷變化，第5天后，染毒組與對照組之間的差別基本穩定，因此選擇第5 天的載荷圖來進行分析（圖3）。圖3中每個點代表代謝物譜上的一個組分，大多數點集中在原點附近，只有少數點遠離原點，遠離原點的點為大鼠尿液在染毒過程中發生了顯著變化的代謝物，其中可能包含潛在的生物標志物。

ON給藥組與對照組的t檢驗圖如圖4所示?？v坐標值越大說明該組分偏離原點的位置越遠，

二羥基喹啉2甲酸（黃尿酸）、色氨酸（Trp）及N乙酰5羥色胺、RG13022和十六碳烯酸。其中，Trp為人體必需氨基酸，其代謝產物參與體內許多重要的生理活動；黃尿酸和N乙酰5羥色胺為Trp的代謝產物，而N乙酰5羥色胺又是大腦松果體褪黑激素合成的前體物質^[12]。3種標志物之間相關代謝途徑如下：（1）Trp通過肝內色氨酸吡咯酶催化，經犬尿酸原代謝為犬尿酸或3羥犬尿酸原，后者再繼續代謝為黃尿酸，犬尿酸或黃尿酸自尿液排出體外；黃尿酸含量變化與多種疾病密切相關，當維生素B6缺乏時，色氨酸代謝異常，尿液中黃尿酸的含量增大^[13]; （2）Trp通過色氨酸經化酶的作用生成5羥色氨酸，再脫羧生成5羥色胺（5HT）。5HT作為一種神經遞質，具有調節情緒、睡眠和覺醒、食欲、疼痛、應激等行為功能的作用。另外，5HT還具有調節血管伸縮的功能，其含量的變化與心血管疾病有關^[14]; （3）5HT在N乙?；D移酶的作用下，轉化成N乙酰5羥色胺， 最后合成褪黑激素^[12]。褪黑激素參與一系列代謝調節活動，控制動物的生物節律，且對性激素有拮抗作用^[15]。同時，N乙酰5羥色胺和褪黑激素還具有抗氧化特性，通過清除過氧自由基參與細胞的抗氧化作用，降低細胞內活性氧的濃度^[16]。本研究中，聯合染毒后，尿液黃尿酸、色氨酸及N乙酰5羥色胺明顯上升，根據上述代謝途徑推測，可能是由于NP和OP促進機體蛋白質的大量分解，導致游離色氨酸增加，色氨酸增加導致代謝產物黃尿酸排出增加、轉化生成的N乙酰5羥色胺增加，同時也有可能褪黑激素合成受阻導致N乙酰5羥色胺堆積，以致排出增加。由于代謝的改變，推測NP和OP的聯合毒效應可能表現在干擾蛋白質的代謝，通過5HT合成途徑影響神經系統活動和心血管功能，通過褪黑激素合成途徑干擾生物節律、細胞的抗氧化。文獻\\表明，NP和OP的毒性機制主要是通過與體內雌激素受體結合，影響內分泌系統的調節功能。本實驗結果提示，其內分泌干擾作用也可能通過影響褪黑激素的合成間接影響性激素的平衡。 

RG13022是一種血小板源生長因子（PDGF）受體抑制劑^[17]。PDGF是多種細胞（如成纖維細胞、平滑肌細胞、膠質細胞）的促有絲分裂劑， 通過與靶細胞膜上相應受體結合， 啟動細胞內多條信號轉導通路， 形成復雜的信號網絡， 在不同組織細胞中起主要作用的信號通路具有特異性^[17]。本研究中RG13022含量升高，推測NP和OP可能會通過抑制PDGF與受體的結合而對細胞的信號傳遞產生毒性。此外，尿液中十六碳烯酸排出增加，表明NP和OP的毒性也可能影響脂類的代謝。

4 結 論

本研究觀察了NP和OP聯合染毒的代謝組學特征，劑量毒性效應分析顯示，隨著染毒劑量的增加，壬基酚和辛基酚對大鼠的毒性增大；時間毒性效應分析顯示，隨著染毒時間的延長，大鼠尿液代謝譜的變化越來越明顯，表現出一定的時間軌跡。根據PCADA載荷圖分析，結合t檢驗，篩選出染毒組和對照組中具有明顯差異的5種化合物，通過查詢代謝物數據庫，推斷這5種生物標志物可能是：4，8二羥基喹啉2甲酸（黃尿酸）、色氨酸及N乙酰5羥色胺、RG13022和十六碳烯酸。同時，根據生物標志物參與的代謝途徑，推測NP和OP聯合染毒誘導的毒性效應可能涉及蛋白質代謝、神經系統和心血管系統、生物節律、細胞抗氧化、性激素的平衡，另外還可能影響細胞的信號傳遞和脂類代謝。

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Study on Urine Metabonomics of Joint Exposure to

Nonylphenol and Ocytlphenol

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LIU ChunHong1，2， WANG WeiHua1， SUN YuanMing1，2， LIN Feng3， ZHANG MingMing1

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1（College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642）

2（The Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province， Guangzhou 510642）

3（Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center Food Testing Lab.， Guangzhou 510623）

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Abstract Metabonomics approach was applied to investigate the effects of joint exposure to nonylphenol（NP） and ocytlphenol（OP） in sprague dawley rat. The metabolites in urine samples were detected by high performance liquid chromatography coupled with timeofflight mass spectrometry （HPLC/QTOFMS）. Timeresponse and doseresponse toxicity were observed based on the principle components analysis （PCA）. Meanwhile， the potential biomarkers were screened out according to PCA， discriminant analysis （DA） and ttest， and identified with the Metlin Scripps Center for mass spectrometry metabolite database. The results indicated that the contents of xanthurenic acid， tryptophan， Nacetylserotonin， RG13022 and hexadecenoic acid changed significantly in urine after exposure to NP and OP， which might be latent biomarkers. Joint exposure of NP and OP might produce toxic effects on protein metabolism， nervous system， cardiovascular system， biorhythm， cell antioxidant activity and balance of sex hormone. In addition， their toxicity might involve cellular signal transduction and lipometabolism. This study not only revealed the toxicity characteristics of combined exposure to NP and OP， but also provided references for further study on toxic mechanism of Alkylphenol.

Keywords Nonylphenol（NP）; Ocytlphenol（OP）; Metabonomics; High performance liquid chromatography coupled with timeofflight mass spectrometry; Biomarker

（Received 22 April 2011; accepted 16 July 2011）