心臟膠原蛋白中交聯氨基酸的質譜分析

摘 要 心臟衰竭可能與心臟膠原蛋白交聯異常有關，因為交聯過程對心臟膠原蛋白的機械強度起決定作用。研究表明，某些交聯氨基酸的含量可以用作對應膠原蛋白交聯異常的分子標記，但心臟膠原蛋白交聯異常的分子標記尚不清楚。本研究建立了串聯質譜的分析方法可以高選擇性的檢測水解膠原蛋白質中兩種重要的交聯氨基酸-吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）。在小鼠心室膠原蛋白酸性水解產物中檢測到DPD，未檢測到PYD，說明PYD與心臟膠原蛋白的交聯過程無關，而DPD在心臟膠原蛋白交聯中起更重要的作用，有可能成為與心臟衰竭相關的分子標記。本研究提供了一種基于質譜的研究心臟膠原蛋白交聯產物的方法，也可用于其它膠原蛋白的分析。

關鍵詞 心臟衰竭；膠原蛋白；交聯氨基酸；質譜; 母離子掃描

1 引 言

膠原蛋白是哺乳動物體內最主要的蛋白質，約占蛋白質總量的30%^[1]。膠原蛋白主要分布于細胞間質，常形成纖維結構，為多細胞生物提供細胞間的機械支撐。而膠原蛋白的機械強度取決于蛋白質亞單位之間通過共價鍵形成的交聯程度。因為交聯可穩定膠原蛋白的纖維結構并提供足夠的強度和粘彈性以實現各種結構功能。交聯程度和形成纖維的數量，密度，取向和尺度決定了膠原蛋白的種類和功能^[2]。例如，人體內的I型膠原蛋白（如心臟膠原蛋白）由3條α鏈組成，每條α鏈分子量約100 kDa （約1000個氨基酸殘基），3條α鏈相互間通過羥脯氨酸殘基之間的氫鍵作用構成緊密穩定的左旋三股螺旋結構（γ）^[3，4]。幾乎所有纖維化的膠原蛋白的交聯都是在賴氨酰氧化酶作用下通過賴氨酸或羥賴氨酸的側鏈醛基化而實現的^[5]。發生在兩條側鏈間的交聯被稱作二價交聯；若三條鏈參與，則是三價交聯或成熟交聯。多種不同的交聯方式可能同時存在于一種纖維狀膠原蛋白中^[6]。此外賴氨酰氧化酶的活性可以被β-氨基丙腈，EDTA，D-青霉胺及其它羰基試劑抑制。

近年來，交聯過程在臨床醫學上的重要性引起了廣泛關注。例如，當細胞間質的成分因血壓升高而發生變化時，細胞間質纖維膠原蛋白的合成，降解，以及交聯均可能引發心臟衰竭^[7，8]。研究還發現血壓升高會引起心臟纖維膠原蛋白總量，膠原蛋白交聯的比例，及賴氨酰氧化酶活性的顯著變化。而且基因表達，酶活性及交聯過程還與心室剛度相關聯^[9]。統計表明， 高血壓每年造成全球500萬人早亡，占世界總死亡人數的13%，其中美國約2萬人^[10]。所以，研究心臟膠原蛋白的交聯，心室剛度，賴氨酰氧化酶活性及基因調控之間的關系有重要的科學意義和應用前景。本研究將著重闡述如何建立串聯質譜法來鑒定存在于膠原蛋白中兩種常見的結構近似的交聯氨基酸--吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD），為進一步研究交聯作用與心臟疾病間的關系提供分析支持。吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）是軟骨和骨骼中常見的三價交聯產物^[11]。文獻多關注于它們作為生物分子標記在膠原蛋白代謝中的作用^[12，13]。例如，高于正常的吡啶諾林及羥賴氨酸被視作成骨不全癥的標志^[14]，以及通過檢測尿中的PYD和DPD含量來監測骨病^[15]。而由于心臟膠原蛋白的復雜性及方法的限制，目前關于PYD和DPD在心臟膠原蛋白中的作用尚不清楚。本研究將通過串聯質譜法檢測膠原蛋白水解產物中的PYD和DPD，并揭示PYD和DPD與心臟膠原蛋白交聯的關系。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD），購自Quidel （San Diego， CA， USA）。HPLC級甲醇，水，乙腈，乙酸，三氟乙酸（TFA）均購自Sigma-Aldrich （St. Louis， MO， USA）。

2.2 樣品準備

2.2.1 小鼠心臟膠原蛋白的分離 用異氟醚將小鼠麻醉，再將其頸椎脫位。取出心臟并除去前室，活瓣，右心室及乳頭肌等。立即稱重并將左心室放入1.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中。用剪刀將左心室剪碎。混合物再被轉移到較大試管中，加入10倍體積的NaOH溶液。4 ℃下靜置24 h后高速離心20 min （10000 r/min）。除去上層清液，膠原蛋白沉淀放入10倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液中。再次在4 ℃下靜置24 h后離心分離，膠原蛋白轉移至2 mL試管中，加入1 mL 水振蕩清洗再離心分離。用水清洗3次后，純化的膠原蛋白儲存在－20 ℃。

2.2.2 硼氫化還原膠原蛋白 將1%樣品重量的NaBH4溶解于0.1 mmol/L NaOH溶液中，再加入樣品，室溫放置3 h并不時振蕩， 加入冰醋酸至pH＝2。在4 ℃下離心分離，除去上層清液。加入1 mL水清洗。重復2次用水清洗。樣品用真空離心蒸發濃縮器蒸干。

2.2.3 酸水解膠原蛋白 將1 mL 6 mol/L HCl加入5 mg樣品中。將混合物放入110 ℃烤箱內20 h。然后將樣品蒸干儲存在－20 ℃冰箱中。

2.2.4 低能碰撞誘導解離（CID） 實驗使用Applied Biosystem Q-trap 4000型質譜儀 （Foster City， CA），裝配納流噴霧電離源，使用正離子模式。PYD和DPD標準樣用甲醇-水混合物（70∶30， V/V）稀釋10倍。在膠原蛋白水解產物中加入200 L甲醇-水混合物（70∶30， V/V），充分振蕩后，離心分離，取上層清液用作分析。質譜儀優化后的參數為： 進樣流速為2.0 L/min。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為25～45 eV。碰撞室的壓力維持在1 Pa左右。裂解實驗中選擇單一同位素前體離子以去除其它同位素峰的干擾。

3 結果與討論

3.1 PYD和DPD的子離子掃描譜（Product Ion Spectra）

PYD和DPD具有類似的化學結構 （圖1），它們的分子離子峰分別出現在m/z 429和413。圖2a是PYD的MS/MS譜。分子離子峰位于m/z 429。分子離子活化后，可觀察到幾條裂解途徑。首先， 圖1 吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）的化學結構，自然狀態以陽離子形式存在。唯一區別是R3支鏈上的OH和H

Fig．1 Chemical structures of pyridinoline （PYD） and deoxypyridinoline （DPD）， which naturally exist as cations. The only difference is between OH and H in R3

通過中性丟失氨（17 Da）產生m/z 412的碎片離子。分裂掉N-烷基化的R3側鏈形成m/z 267的碎片離子，進一步失水產生m/z 249的離子。位于m/z 146的碎片峰是R3＋離子，而m/z 128的離子是R3＋失水的產物，m/z 100是R3＋中性丟失HCOOH（46 Da）的結果，同理m/z 82是R3＋中性丟失\\產生的。

DPD的MS/MS譜如圖2b所示，分子離子峰位于m/z 413。DPD經歷類似于PYD的裂解途徑。中性丟失氨產生m/z 396的碎片離子。這里同樣產生了R3＋離子（m/z 130），再丟失HCOOH產生m/z 84的產物離子。特別值得注意的是，DPD同樣分裂掉N-烷基化的R3側鏈并失水，分別產生了m/z 267和249離子，這一特征與PYD相同。比較PYD和DPD的子離子掃描譜，不難看出它們具有類似的裂解途徑。DPD的裂解途徑相對簡單，因為DPD的R3側鏈比PYD的R3側鏈少一個羥基（圖1），因而DPD的失水途徑大大減少。

圖2 （a） 吡啶諾林（PYD）和（b）去氧吡啶諾林（DPD）的子離子掃描譜。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV

Fig．2 Product ion spectra of （a） PYD and （b） DPD. N2 was used as collision gas， and the collision energy was 45 eV

3.2 PYD和DPD的母離子掃描譜 （Precursor ion scanning）

三重四極桿質譜儀（QqQ）（或Q-trap）的前體離子掃描模式是從復雜混合物中識別目標分子的有力工具。前體離子掃描模式固定Q3的DC和RF，使得只有某一特定m/z值的離子被檢測到。通過掃描Q1使一定范圍的m/z離子得以通過Q1，到達碰撞室（q），發生裂解。最終只有能夠產生某一特定碎片離子的前體離子會出現在譜圖上。本實驗中膠原蛋白的水解產物是包含各種氨基酸和交聯氨基酸及其它雜質的混合物。要通過色譜或其他技術提純PYD或DPD幾乎是不可能的或非常困難。所以，前體離子掃描非常適合用于檢測該復雜體系中的PYD或DPD。 圖3 PYD和DPD混合標準樣的母離子掃描譜。掃描Q1使全部離子（m/z 200～500）通過，Q3固定在m/z 267。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV

Fig．3 Precursor ion scan MS/MS spectrum of PYD and DPD standard mixture. Q1 was scanning to transmit all the ions （m/z 200－500） formed at the Nanospray source， and Q3 was fixed at m/z 267. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 45 eV

PYD和DPD的裂解行為近似，更重要的是它們都產生m/z 267的碎片離子。該離子峰可用作指紋特征峰，同時由于該碎片是通過開環反應產生的，因而比脫水或脫氨的中性丟失更具獨特性。此外，選擇該峰的另一優勢在于可以同時檢測PYD和DPD。PYD和DPD標準樣品的母離子掃描譜如圖3所示，只有兩個主峰出現，m/z 429和413，分別對應PYD和DPD，顯示了m/z 267的前體掃描具備高選擇性，其它雜質的干擾很少。但是，譜圖上仍然可見一些低強度前體離子，如m/z 438和388，這說明當該掃描應用到膠原蛋白水解產物時，雜質影響不可避免，因為PYD和DPD的濃度不會很高且樣品組分非常復雜。

為了找到PYD和DPD最佳的指紋特征片段，選擇PYD和DPD最小的裂解片段，分別為m/z 82和84 （圖2）。選擇這兩個峰的原因是由于它們是賴氨酸或羥賴氨酸殘基的一部分（圖1），因而除PYD和DPD外，其它交聯氨基酸也有可能產生m/z 82或84的殘片，所以它們有可能成為識別其他交聯氨基酸的特征峰。圖4是PYD和DPD標準樣混合物的m/z 84和82的母離子掃描譜。在m/z 84的母離子掃描譜（圖4a）中可看到很強的m/z 413峰，說明m/z 84的主要貢獻來自于DPD；還出現一組低質量峰及m/z 429弱峰，這說明其選擇性不高。同樣，m/z 82的前體掃描也有類似問題（圖4b），除了最強的m/z 429（PYD）外，還有其它信號出現。至此說明選擇m/z 267作前體掃描的選擇性要大大高于選擇m/z 84或82，原因可能是小質量離子有更多途徑生成，而且產生小質量離子的概率也高于大質量離子。綜合圖3和圖4的結果，表明m/z 267是識別DPD和PYD的最佳選擇。

圖4 PYD和DPD混合標準樣的母離子掃描譜

Fig．4 The precursor ion scan MS/MS spectra of PYD and DPD standard mixture

a. Q3固定在m/z 84； b. Q3固定在m/z 82。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV。 a. Q3 was fixed at m/z 84; b. Q3 was fixed at m/z 82. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 45 eV

3.3 小鼠心室膠原蛋白水解產物的全掃描和母離子掃描譜

水解的膠原蛋白含有自由氨基酸和交聯氨基酸以及可能的其它雜質，其全掃描質譜如圖5a所示。由于成分非常復雜，圖譜背景信號很強，因而期待的m/z 413和429的峰難以從中辨認。m/z 175峰符合精氨酸分子離子的質量，對比文獻\\，m/z 175的MS/MS譜符合精氨酸的特征（圖5b），這可證明所測樣品確是水解的蛋白質，說明蛋白質的提取這一精細操作是成功的。

圖5 （a） 小鼠心室膠原蛋白水解產物的全掃描質譜。（b） 圖5a中m/z 175離子的子離子掃描譜。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為25 eV

Fig．5 （a） Full scan MS spectrum of hydrolyzed mouse ventricle collagen; （b） product ion spectrum of the peak at m/z 175 in Fig.5a. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 25 eV

圖6a為小鼠心室膠原蛋白水解產物的母離子掃描（m/z 267）。雖然背景信號比PYD和DPD的標

圖6 （a） 小鼠心室膠原蛋白水解產物 （b） 溶劑的母離子掃描譜。Q3固定在m/z 167。碰撞氣體為氮氣，碰撞能量為45 eV

Fig．6 The precursor ion scan MS/MS spectrum of hydrolyzed mouse ventricle collagen（a） ; solvent（b）. Q3 was fixed at m/z 267. N2 was used as the collision gas， and the collision energy was 45 eV

準樣（圖3）強很多，但對應于DPD的m/z 413信號依然可見。同時PYD的信號未檢測到。文獻\\表

明，PYD幾乎只在骨膠原蛋白中存在，此結果與本研究一致。譜圖中除m/z 413外，還有許多其它峰，但m/z 413的信號是最強的。盡管如此，由于信號絕對強度不高（～3200 cps），因而可能懷疑該信號為噪音。本實驗在不同時間（天）重復多次，均獲得相同結果。此外，測試了甲醇-水（70∶30，V/V）溶劑的前體掃描（m/z 267）作為空白實驗（圖6b），未發現m/z 413的信號，更重要的是信號強度最大約300 cps，遠小于實際樣品。對比圖6a和圖6b，可以確認DPD存在于心臟膠原蛋白，并且是其交聯的方式之一。

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4 結 論

研究了兩種重要的交聯氨基酸吡啶諾林（PYD）和去氧吡啶諾林（DPD）的質譜裂解特征。基于PYD和DPD的裂解途徑，m/z 267被選作識別PYD和DPD指紋特征峰。m/z 267前體掃描具有對PYD和DPD的高度選擇性。從小鼠心室膠原蛋白水解產物中檢測到了DPD，未檢測到PYD，說明PYD與心臟膠原蛋白的交聯過程無關。而DPD在心臟膠原蛋白交聯中起更重要的作用， 因此，有可能成為心臟衰竭相關的分子標記。本研究采用的質譜研究心臟膠原蛋白交聯產物的方法，也可用于分析其它膠原蛋白的交聯產物。

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Mass Spectrometric Analysis of Cross-linked Amino Acids in Collagen

JIANG Wei*1， YU Gang2

（1Novartis Institutes for Biomedical Research， Cambridge， MA 02139 USA， 2Department of Earth and

Planetary Sciences， Harvard University， Cambridge， MA 02138 USA）

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Abstract Cross-linking plays a critical role in determining the mechanical strength of heart collagen， and its malfunction is probably related to the occurrence of heart failure. Studies show that the content of some cross-linked amino acids can be used as biomarkers for the abnormal cross-linking of their corresponding collagens. However， it is still unclear about the biomarkers for the unusual cross-linking in heart collagen. Hence we present a tandem mass spectrometry method that enables highly selective identification of two important crosslink， amino acids-pyridinoline （PYD） and deoxypyridi-noline （DPD） in hydrolyzed collagen. DPD is detected in acid hydrolyzed mouse ventricle collagen， while PYD not， indicating that PYD is not related to the cross-linking processes in heart collagen， but DPD plays a more significant role， so DPD might become a biomarker for heart failure. Overall， this study provides a mass spectrometry based method to investigate the cross-linking products in mouse heart collagen， which can be also applied to other collagens

Keywords Heart failure; Collagen; Cross-linked amino acid; Mass spectrometry; Precursor ion scan

（Received 28 June 2011; accepted 2 September 2011）