微透析與高效液相色譜在線聯用技術校正大鼠皮下阿魏酸線性探針

摘 要 采用微透析與高效液相在線聯用技術（MDHPLC online）建立并驗證大鼠皮下阿魏酸微透析線性探針體內外校正方法。以磷酸鹽緩沖溶液為灌流液，微透析灌注液流速為2m）為色譜柱，流動相為甲醇水（含0.5%乙酸） （35∶65， V/V），流速1 mL/min，檢測波長314 nm的HPLC色譜條件下進行在線檢測，阿魏酸在0.1～80 mg/L范圍內回歸方程線性關系良好， A＝159044C－2607 （r＝1）， 阿魏酸日內精密度RSD分別為0.8%，0.3%和0.5% （n＝5）；日間精密度RSD分別為0.2%，0.3%和0.4% （n＝5），重現性與穩定性RSD分別為0.7%和1.1% （n＝5） 。增量法和減量法測定阿魏酸線性探針體內外回收率分別為47.23%±0.94%和20.37%±1.37%，阿魏酸適宜進行微透析實驗。應用MDHPLC online對中藥當歸阿魏酸進行測定，使取樣、進樣和分析監測同時進行。

關鍵詞 高效液相色譜； 微透析； 在線聯用技術； 阿魏酸； 線性探針

1 引 言

丙烯酸衍生物阿魏酸單體是從當歸中提取分離得到的。當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv）Diels的干燥根，為臨床常用中藥，具有活血補血之功效。據現代研究證明，當歸揮發油主要含藁本內酯（47%）和丁烯基酰內酯（11.3%），另有月桂油及樟腦酸等。其中水溶性物質有多種氨基酸、丁二酸及阿魏酸^[1～3]。阿魏酸（Ferulic acid，4羥基3甲氧基苯丙烯酸，結構式見圖1）在細胞壁中與多糖和蛋白質結合成為細胞壁的骨架，是其主要有效成分之一。現代藥理研究顯示：阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗凝抗血栓、擴張微血管、增加冠脈流量、解除血管痙攣、防止高血壓、抗心肌缺血、缺糖、缺氧等藥理作用。阿魏酸還被歐美國家批準用于食品抗氧劑。在化妝品行業也應用廣泛，是最好的天然防曬劑，用作皮膚美白劑和細胞分化促進劑^[4～8]。 

阿魏酸分子式C10H1004，分子量194.1，溶于水，水溶液在不同pH值條件下均比較穩定，但見光或受熱后極易發生異構化而降解。故在實驗過程中，需采取避光防熱措施，甚至在避光室中進行實驗，極為不便。本研究構建的微透析高效液相在線聯用技術（MDHPLC online）具有自動取樣、自動進樣、自動檢測等優點，彌補了阿魏酸不宜見光及受熱的不足，為研究中藥當歸中的阿魏酸提供了一種全新、可靠的分析檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

微透析與高效液相在線聯用技術的構建（MDHPLC online，自制）：包括微透析設備（美國BAS公司，灌注器推進泵MD1001、四聯流量控制器MD1020K、灌注器MD0100、流速控制器MD1000，MD1020、3個灌注器架MD1002）；LC10AD高效液相色譜儀（日本島津公司，配SPD10AVP可變波長紫外檢測器）、10孔自動進樣閥（美國VICI公司），通過聚丙烯管路與美國生物兼容性粘合劑（Cyberbond）將微透析設備、10孔自動進樣閥、HPLC系統連為一體，微透析設備動態收集透析液樣品，儲存于10孔自動進樣閥定量環中，啟動10孔自動進樣閥VCOM軟件，以電動力方式將透析液注入到HPLC色譜柱中，HPLC系統對其分析檢測，實現在線聯動；DF101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州鞏義市予華儀器有限責任公司）；pH計（MP220型，瑞士Metter公司）；AG285型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；微透析體外回收率校正實驗反應瓶（自制，專利號：ZL200620048875.4）；動物保溫墊（自制，專利號：ZL200520041839.6），線性探針（自制，專利號：ZL200520046607.X，膜長30 mm）。

阿魏酸標準品（批號：110773200611，中國藥品生物制品檢定所）；阿魏酸原料藥（萬馬合成藥有限公司）；Veet脫毛膏（法國Veet公司）；甲醇（色譜純，SigmaAldrich公司）；戊巴比妥鈉（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）；水為三次蒸餾水（本院制劑室生產）；其它試劑均為分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準品儲備液的配制 準確稱取阿魏酸標準品100 mg于100 mL容量瓶中，加PBS溶液超聲溶解并定容，配制成1000 mg/L阿魏酸標準儲備液。

2.2.2 標準曲線工作液配制 取阿魏酸標準品儲備液，以PBS稀釋，分別配制成0.1，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和80.0 mg/L的系列標準曲線工作液。

2.2.3 色譜條件 HypersilC18分析色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

3 結果與討論

3.1 阿魏酸方法學考察結果

3.1.1 阿魏酸透析樣品的分離 分別以乙腈水（15∶85，20∶80，30∶70，V/V），甲醇水（15∶85，20∶80，30∶70，V/V）為流動相，考察阿魏酸標準品的峰型及響應值，最終確定流動相為甲醇水（35∶65，V/V），在2.2.3節的色譜條件下，阿魏酸標準品得到很好的分離，峰形良好且無干擾（圖1）。 圖1 體外空白PBS色譜圖（a），阿魏酸標準品色譜圖（b）

Fig．1 Chromatograms of blank PBS （a） ， ferulic acid standard preparation （b）

3.1.2 線性回歸方程、檢出限與定量限 取各濃度標準曲線工作液分別進樣10