96孔板法用于高通量血管緊張素轉化酶抑制劑體外檢測

摘 要 為在體外迅速檢測血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）的抑制活性，選用96孔板，以呋喃丙烯酰三肽（FAPGG）為模擬底物，通過檢測血管緊張素轉化酶（ACE）酶解FAPGG生成N\\2苯丙氨酸（FAP）和雙甘氨肽（GG）后340 nm處吸光值的下降衡量ACE的活性，采用加入ACEI前后ACE的活性變化衡量ACEI的活性。考察了不同緩沖體系、Cl－濃度、ACE酶活性（ACE酶濃度）、緩沖體系的pH值等對上述檢測模型反應體系的影響，建立了高通量降血壓肽活性體外檢測方法，本方法最多可同時檢測96個樣品的ACE抑制活性，上機分析時間僅需10 s。不同批次活性平行測定的相對標準偏差均小于0.001%，p＝0.667＞0.05，各測定結果無顯著差異，重現性好，精密度較高。采用本方法測定了商品血管緊張素轉化酶抑制劑Captopril的IC50值為16.19 nmol/L，與文獻報道的測定結果一致。

關鍵詞 高通量，血管緊張素轉化酶抑制劑，活性檢測

1 引 言

人體內的血管緊張素轉化酶（ACE， EC3.4.15.1）催化血管緊張素I生成血管緊張素II，后者是強烈的血管收縮劑和腎上腺皮質類醛甾酮釋放的激活劑^[1]。血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）可以通過抑制血管緊張素II的生成，在人體內起到調節血壓的作用^[2，3]。

目前，ACEI活性檢測主要包括體外檢測和體內檢測（動物降血壓試驗）。體外檢測模型簡單，快速、準確，重復性高，在初期的研究和工藝篩選過程中，往往使用體外檢測^[4]。因此，選擇一種快速高效、準確可靠的體外檢測方法是ACEI類藥物研究過程中要首先解決的問題。

體外檢測方法的檢測原理：通過加入血管緊張素Ⅰ的模擬底物，在一定條件下與ACE作用，產生具有特異吸收特性的物質。通過檢測加入ACEI前后這種物質吸收特性的差異，計算該物質對ACE的抑制率^[4，5]。

常用血管緊張素Ⅰ的模擬底物有馬尿酰組氨酰亮氨酸（HippurylLhistidylLleucine，HHL）和呋喃丙烯酰三肽N\\Lphenylalanylglycylglycine，FAPGG）。ACE可酶解HHL生成馬尿酸（Hippuric acid， HA）和二肽（HistidylLleucine）。用于檢測ACEI抑制效果的常用方法是利用紫外比色法檢測添加ACEI前后HA生成量變化^[1]，但需要先提取出馬尿酸，操作繁瑣，耗時，檢測結果誤差難以控制。許多研究者對這一方法進行了改進，利用HPLC或高效毛細管電泳等方法定量檢測馬尿酸^[3，4]，無須提取步驟，提高了檢測的準確性，靈敏度和重現性也較好，但樣品前處理及檢測過程耗時，需消耗大量有機溶劑或緩沖溶液，檢測成本較高。Holmquist等^[5]建立了一種ACE活性檢測方法，利用FAPGG作為ACE作用的底物，將其水解成FAP（N\\2苯丙氨酸）和GG （雙甘氨肽）。這些肽類的釋放會減少FAPGG在預期波長的吸光度。文獻\\的方法與之類似。Vermeirssen等^[8]在該方法的基礎上建立了ACEI活性檢測方法。與文獻\\相比，省去了乙酸乙酯萃取步驟，操作簡單，快速準確，適用于ACE抑制劑的大規模快速檢測。Vermeirssen等^[9]利用此方法對幾種商品ACE抑制劑進行實驗，ActisGoretta^[10]和Murray ^[11]等對該方法進行了不同程度的改進。但是這些方法都是基于分光光度法，試劑用量大，檢測周期長、檢測成本較高。

本研究采用微量法直接測定ACEI活性，省去了萃取步驟，簡化實驗操作，用96孔板代替傳統的比色皿，用酶標儀代替紫外分光光度計，試劑用量少，大幅提高了檢測速度和精密度，建立了一種方便快捷、試劑用量少、經濟實用的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料



PHS3C精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）；CARY100紫外掃描分光光度計（美國瓦里安公司）；MSS全波長酶標儀（美國熱電公司）；Avanti TMJ25高速冷凍離心機（美國BecKman儀器有限公司）；SPX250B生化培養箱（常州國華電器有限公司）。

血管緊張素轉化酶（ACE， EC3.4.15.1），參考了文獻\\的方法，自豬肺中提取；FAPGG， FAP， GG， HEPES （羥乙基哌嗪乙磺酸）， Captopril（商品ACEI）和HHL，購自Sigma公司；其它化學試劑均為國產分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1 ACE活性檢測 FAPGG最大吸收峰在340 nm附近，用ACE將FAPGG水解成FAP和GG，FAPGG的水解使340 nm附近處吸光度降低，降低的速率與ACE 活性成正比，通過測定FAPGG在340 nm附近處吸光度下降速度可計算出ACE的活性，進而根據添加ACEI前后ACE酶活的變化間接反映ACEI的抑制活性。

2.2.2 反應緩沖體系的選擇 分別配制濃度為40， 60， 80和100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液和HEPES緩沖液（pH 8.3、含200 mmol/L NaCl），分別用以上緩沖液配制1.0 mmol/L FAPGG溶液，測定不同緩沖體系下ACE酶活性。

2.2.3 Cl－濃度及緩沖液pH值對ACE活性的影響 用超純水配制含0， 100， 200， 300和400 mmol/L NaCl pH 8.3的80 mmol/L緩沖液，分別用以上緩沖液配制1.0 mmol/L FAPGG溶液，測定不同Cl－濃度下ACE酶活性。用超純水配制不同pH值的80 mmol/L的緩沖液，分別用以上緩沖液配制1.0 mmol/L FAPGG溶液，測定不同pH下ACE酶活性。

2.2.4 標準曲線的繪制 用80 mmol/L HEPES緩沖液（pH 8.3）配制0， 0.1， 0.25， 0.5， 0.75， 0.9和1.0 mmol/L FAPGG標準液以及FAP＋GG（1∶1，V/V）標準溶液，以HEPES作為空白，測定確定的最佳吸收波長下的吸光值。分別將0.0～1.0 mmol/L FAPGG的順序和1.0～0.0 mmol/L FAP＋GG 的梯度混合（所有混合液中FAPGG和FAP總濃度為1 mmol/L），以HEPES作為空白，分別測定最佳吸收波長下的