多壁碳納米管和分子印跡膜修飾電極檢測豬尿液中萊克多巴胺

摘 要 采用原位熱聚合技術，分別以多壁碳納米管（MWCNs）和分子印跡膜（MIM）修飾絲網印刷電極（SPE），與多壁碳納米管和非分子印跡膜（NIM）修飾的絲網印刷電極組合在一起，并將其組合的絲網印刷電極通過電極插口與便攜式電導儀相連接，組裝成檢測萊克多巴胺殘留的電導型傳感器，優化檢測條件，并建立了檢測萊克多巴胺的標準曲線， 測試了實際豬尿樣中萊克多巴胺的含量。通過掃描電鏡分析了該分子印跡膜的表征結構。結果表明， 在萊克多巴胺分子印跡膜表面形成了大量印跡微孔。本傳感器裝置檢測萊克多巴胺具有很高的靈敏度和特異性，檢出限為0.033 mg/L，線性范圍為0.33～8.0 mg/L，基于豬尿樣的檢測回收率達到91%～98%，可實現現場快速檢測。

關鍵詞 多壁碳納米管； 萊克多巴胺； 分子印跡膜； 電導型傳感器

1 引 言

萊克多巴胺（RAC）是苯乙醇胺類β2腎上腺素興奮劑，能夠顯著提高動物胴體的瘦肉率和降低體內脂肪的沉積率^[1～5]。然而，當人們食用含有萊克多巴胺等一些促生長興奮劑的肉類食物后，會在人體內殘留，嚴重危害人體健康和生命安全。因此，包括我國在內的許多國家和組織都禁止在動物性飼料中添加萊克多巴胺，并對萊克多巴胺在動物組織中的最大殘留限量（Maximal residue limits， MRL）做出了明確規定。其中，世界衛生組織食品添加劑專家聯席委員會（JECFA）規定在肝臟、腎臟、肌肉中MRL分別為40，90和10 ng/g。研發高效檢測萊克多巴胺的新方法是控制萊克多巴胺濫用的關鍵環節之一。目前，萊克多巴胺的常用檢測方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA）、免疫親和柱層析法、色譜分析方法和傳感器方法等^[6～16]。上述檢測方法雖然準確、靈敏，但樣品前處理及操作過程繁瑣，費用昂貴，不適宜于現場大量篩選。因此，有必要研制出高效和快速檢測萊克多巴胺的方法。分子印跡聚合物 （Molecularly imprinted polymers， MIP）和MIM對目標化合物具有高度選擇性，在樣品的分離、富集、檢測領域得到廣泛應用^[16～20]。有關利用分子印跡膜為感受器檢測豬尿中電導型傳感方法的研究尚未見報道。

本實驗采用原位熱聚合技術，將多壁碳納米管（MWCNs）和分子印跡膜依次修飾在絲網印刷電極上，再將絲網印刷電極通過電極插口與便攜式電導儀相接，組裝成檢測萊克多巴胺殘留的電導型傳感器。通過更換帶有印跡膜的電極條，將待測樣品直接滴入電極條工作區， 即可實現多個樣品的快速檢測。此電導型傳感器具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快和成本低等優點，具有廣闊的實際應用前景。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FEI SIRION200型場發射掃描電鏡（美國FEI公司）； XMTD204電熱恒溫水浴鍋（上海博泰實驗設備有限公司）；索氏提取器（江蘇海門華盛實驗儀器有限公司）；SB80超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式高速離心機 （北京醫用離心機廠）；CON 6/TDS 6 電導儀（新加坡OAKTON公司）；一次性絲網印刷電極條（臺灣芯寶科技股份有限公司）。m，純度＞99%，Sigma公司）；甲基丙烯酸（MAA，國藥集團化學試劑有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯 （EGDMA，Sigma公司）、偶氮二異丁腈 （AIBN，Sigma公司）、HNO3、二氯亞砜 （SOCl2）、H2O2、H2SO4、醋酸、醋酸鈉、甲醇和乙醇等均購于上海醫藥集團上海化學試劑公司，上述試劑均為分析純試劑。伯瑞坦羅比森緩沖溶液（BR buffer）以H3PO4、乙酸、硼酸配制；碳酸鹽緩沖液以無水碳酸鈉和NaHCO3配制；TrisHCl緩沖液；PBS緩沖液以NaH2PO4和Na2HPO4配制; 醋酸鹽緩沖液以醋酸鈉和醋酸配制。實驗用水均為二次蒸餾水。

2.2 多壁碳納米管修飾絲網印刷電極

取未經過處理的多壁碳納米管0.30 g， 加入0.30 mL甲醇，超聲1 h后，可以看到多壁碳納米管均勻稀釋在甲醇溶液中。絲網印刷電極的基本結構是在PVC基板上按設計圖案印制導電銀漿層、導電碳漿層及絕緣層。絲網印刷電極在使用前用20% H2SO4和10% H2O2在玻璃器皿中清洗30 min，然后再用蒸餾水反復清洗3次，使其表面干凈，將其自然晾干，于－4 ℃保存備用。

2.3 印跡膜（MIM）和非印跡膜（NIM）的制備

取0.033 g 萊克多巴胺（模板分子）和0.034 mL MAA溶于0.670 mL二甲亞砜中，超聲10 min，放置2 h進行預聚合。再加入0.310 mL EGDMA和0.030 g AIBN，超聲混合均勻，充氮氣除氧10 min，留作備用。取0.6 L的上述聚合液均勻涂布在絲網印刷電極工作區，將電極條固定在玻璃皿中，抽真空后置于60 ℃的水浴鍋中熱聚合24 h后，取出電極條置于－4 ℃冰箱中冷卻、保存2 h，可以看到絲網印刷電極上涂布的聚合液區域出現半透明蠟狀物質，即得到萊克多巴胺分子印跡膜（MIM）修飾的絲網印刷電極。用甲醇/乙酸（9∶1， V/V）溶液洗脫48 h，用甲醇洗去乙酸，于－4 ℃保存備用^[16]。

帶有非印跡膜（NIM）的絲網印刷電極條的制作方法同上，區別在于聚合過程中不加入模板分子。

2.4 傳感檢測方法的建立

修飾的絲網印刷電極示意圖如圖1所示，將修飾有MWCNs與MIM的絲網印刷電極條與修飾有MWCNs與NIM的絲網印刷電極條通過兩塊加樣控制擋板粘合為一體，兩電極工作區之間的間隙組成測試樣品加樣區，然后將組裝好的測試電極通過USB接口與電導儀相連（圖2）。

圖1 基于多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的絲網印刷電極結構圖

Fig．1 Fabrication of screen printed electrode （SPE） modified with multiwalled carbon nanotubes （MWCNs） and molecularly imprinted membrane （MIM）

Ⅰ. 絲網印刷電極（SPE）； Ⅱ. 多壁碳納米管修飾的電極條（SPE coated by MWCNs）； Ⅲ. 多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的電極條（SPE modified by MWCNs and MIM）； Ⅳ. 洗脫后的電極條（SPE after elusioning）； Ⅴ. 電導儀探針（conductometric probe）。 1. 接線頭端子（Terminal post）； 2. 導電軌 （Conductor rail）； 3. 絕緣層 （Insulation layer）； 4. 工作區 （Working area）； 5. 多壁碳納米管 （MWCNs）； 6. 分子印跡膜 （MIM）； 7. 洗脫后的分子印跡膜 （MIM after elusioning）； 8. 印跡膜的電極條 （SPE with MIM）； 9. 非印跡膜的電極條（SPE with nonimprinted membrane（NIM））；10. 測試區（Testing area）。L濃度為 10， 15， 25， 50， 100， 150和240 mg/L萊克多巴胺標準溶液，配制成含0.33， 0.50， 0.83， 1.67， 3.33， 5.00和8.00 mg/L萊克多巴胺的測試液。將絲網印刷電極的工作區浸入到緩沖液中，待傳感儀讀數穩定后，記錄此刻電導值（背景值），加入待測樣品，穩定后記錄電導值（終值）。每次檢測結束后更換帶有修飾的絲網印刷電極條，共測試7個濃度，平行測定3次。以扣除背景值的響應信號值為縱坐標，以不同濃度萊克多巴胺為橫坐標，繪制曲線。

圖2 實驗檢測裝置示意圖

Fig．2 Schematic structure of analytical system

1. TrisHCl緩沖液（TrisHCl buffer）； 2. 磁力攪拌器（Magnetic stirrer）； 3. 電導儀（Conductometer）。

3 結果與討論

3.1 MIM和NIM的特征性分析

NIM對目標分子具有一定的非特異性吸咐作用^[21]，本實驗采用FEI SIRION200型發射掃描電鏡對隨機選取數個制備好的MIM和NIM進行表征分析，拍攝的掃描照片如圖 3所示。從圖3A中可清晰地看出有很多凹痕，少量凹痕處出現直徑約20～30 nm的孔隙，可能是由于模板分子被洗脫后而遺留的結構，該結構與分子印跡膜對模板分子的識別和吸附作用密切相關。但也有少量印跡物成團聚集在一起，這可能是由于聚合分子在聚合結束后，聚合分子牽拉及堆積而成。從圖3B中可清晰地看出印跡物表面結構較為均一，孔穴狀結構顯著少于MIM。

為了比較MIM與NIM對模板分子萊克多巴胺的特異性吸附作用，本實驗隨機選擇已制備好的MIM及NIM各20條（MWCNs 已修飾），將MIM與NIM組合在一起的電極條，與NIM與NIM組合在一起的電極條作對比（制作方法見2.4）。將其分別置于含有一定濃度（1 mg/L）的萊克多巴胺的溶液中，每個組合的電極條重復3次，測試并記錄相應電極條的電導值。結果表明，MIM與NIM組合在一起的電導值為（1.72±0.052） ms，而NIM與NIM組合在一起的電導值為（0.043±0.003） ms，由此說明MIM的特異性吸附能力遠大于NIM的吸附能力。

圖3 印跡膜 （A）及非印跡膜 （B）的電鏡掃描圖（×20000）

Fig．3 Scanning electron microscopy （SEM） images of MIM （A） and NIM （B） （×20000）

3.2 基于多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的電導型傳感器的時間響應曲線

考察了傳感器的響應時間對靈敏度的影響（見圖4）。為了保證測試條件的一致性，每個濃度都減去背景電流值。隨著響應時間和濃度的增加，傳感器的響應值也隨之增加。在0 s時，不同濃度的電導響應值在0.8～1.3 ms之間，表明絲網印刷電極的一致性；在30 s后， 電導的響應信號逐漸趨于穩定，表明此時萊克多巴胺分子與洗脫后留下的特殊位點的識別已趨于飽和。因此，本研究應選擇30 s為數據采集的最佳時間。

3.3 多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的電導型傳感器的測試標準曲線

以多壁碳納米管和分子印跡膜為敏感元件的電導傳感方法檢測萊克多巴胺的標準曲線如圖5所示，回歸方程為y＝0.8577＋0.8663x （r＝0.995），檢出限為0.033 mg/L，在0.33～8.00 mg/L 范圍內具有良好的線性關系。而使用非印跡膜作為感受器， 在相同條件下檢測萊克多巴胺標準溶液，在不同濃度的溶液下所獲得的電導值無明顯變化。說明洗脫后的MIM存在與萊克多巴胺分子結構互補的孔穴，溶液中具有電化學活性的萊克多巴胺分子被特異性吸附至MIM表面后，膜本身的電化學活性將發生改變，隨著溶液中萊克多巴胺濃度的變化，而產生相應的傳感器響應信號。

3.4 優化的測試條件

考察了pH值對傳感器響應信號的影響。在強堿的條件下，萊克多巴胺的溶解度非常低；在強酸性條件下，其產生的傳感信號不穩定。因此本實驗在pH 4.0～9.0條件下，對10 mg/L萊克多巴胺標準溶液進行檢測。結果表明： 在弱酸性條件下，傳感器的響應信號逐漸增大，在pH 7.0時，響應信號達到最大值7.65 ms。在堿性條件下，傳感器的響應信號迅速下降，在pH 9.0時，響應信號僅為3.45 ms。因此，本實驗選擇檢測萊克多巴胺的最佳pH值為7.0。

圖4 基于MIM的電導傳感方法檢測不同濃度萊克多巴胺的時間響應曲線

Fig．4 Sensor response versus time in detection of ractopamine with different concentrations

a. 0.33 mg/L; b 0.50 mg/L; c. 0.83 mg/L; d.1.67 mg/L; e. 3.33 mg/L; f. 5.00 mg/L; g. 8.00 mg/L.

圖5 基于多壁碳納米管和分子印跡膜修飾的絲網印刷電極檢測萊克多巴胺的標準曲線

Fig．5 Standard curve for determination of ractopamine on conductometric sensor based on MWCNsMIM modified SPE

圖6 不同緩沖液對電導型傳感器性能的影響

Fig．6 Effect of different buffers on response of conductometric sensor

a. TrisHCl緩沖液（TrisHCl buffer）； b. （HClO4 solution）； c. PBS緩沖液（PBS buffer）；d. BR緩沖液（BR buffer）；e. 碳酸鹽緩沖液 （Na2CO3NaHCO3buffer）；f. 醋酸鹽緩沖液（NaAcHAc buffer）。

分別以10 mg/L萊克多巴胺標準溶液和pH 7.0～0.2 mol/L TrisHCl緩沖液、BR緩沖液、碳酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、高氯酸和醋酸鹽緩沖液為支持液，采用該傳感體系進行檢測。如圖6所示，以TrisHCl為緩沖液時，檢測值最高，其次為HClO4溶液; 以醋酸鹽緩沖液為支持液時，檢測值最低。因此，本實驗選用0.2 mol/L TrisHCl緩沖液（pH 7.0）作為支持液。

考察了離子強度對傳感器測試萊克多巴胺的影響。結果表明， 2 mol/L NaCl， KCl等強電解質對電導測試結果有顯著影響，可使電導值增加1.52～2.65 ms，因而建議在樣品前處理過程中通過液液萃取等方法將高濃度的離子除去。

3.5 干擾實驗

本實驗選用實際樣品中可能含有的違禁獸藥鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇作為干擾物質，將萊克多巴胺和每種干擾物質分別以0.2 mol/L TrisHCl緩沖液配制成干擾測試液，結果見表1。在0.5 mol/L萊克多巴胺標準液和1 mol/L CLB標準液中，測得的萊克多巴胺的濃度差異不顯著。但加入1 mol/L SAL標準液，所檢測出的萊克多巴胺濃度顯著降低。此外，當上述3種溶液混合后，通過電導儀檢測出萊克多巴胺的濃度略有增加。這有可能是干擾物質的一些化學基團也能夠被洗脫后的萊克多巴胺分子印跡空穴所識別，影響了萊克多巴胺分子結合印跡物的表面^[21]。也有學者認為是在檢測的過程中MIM對各特征基團和分子整體進行識別，萊克多巴胺的分子結構與鹽酸克倫特羅差異明顯，不能穩定結合在印跡孔穴中，大部分以布朗運動的形式在印跡孔穴中出入

檢測，其相對標準差（RSD）小于2.7%（n＝5）； 隨機抽取5批次制作的帶有MIM的電極條，檢測同一濃度的萊克多巴胺樣品，其RSD＜3.5%。將制備好的帶有MIM的電極條在－4 ℃冰箱保存3個月后，檢測同一濃度的萊克多巴胺樣品，與剛制備好的電極條檢測結果相比，其RSD＜4.8%。6個月后進行檢測，與初次檢測相比，其RSD＜6.4%。因此該傳感儀的敏感元件的使用壽命多于6個月，通過更換帶有MIM的一次性絲網印刷電極條，該傳感儀可長期使用^[21]。因此，本實驗制備的基于MIM為感受器的電導型傳感儀具有檢測速度快、重復性好、穩定性高等優點， 適用于大批量實際樣品檢測。

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A Conductometric Sensor Based on Screen Printed Electrode Modified

with Multiwalled Carbon Nanotubes and Molecularly Imprinted

Membrane for Determination of Ractopamine in Pig Urine

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ZHANG HongCai， LIU GuoYan， SHANG Jing， WENG ZhiYing， CHAI ChunYan*

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（School of Agricultrue ＆ Biology， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240）



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Abstract First， multiwall carbon nanotubes（MWCNs） were modified on the screen printed electrode（SPE）， and then molecularly imprinted membrane（MIM） and nonimprinted membrane（NIM） were directly synthesized on the modified SPE by using the insitu thermal polymerization techniques， respectively. A conductometric sensor for the detection of ractopamine was assembled by connecting the SPE modified with MWCNsMIM and the other one coated with MWCNsNIM to a conductometer through an electrode slot. Standard calibration curve was established and the determination of ractopamine in pig urine samples also was performed based on this sensor. Superficial characteristic of MIM and NIM was investigated using scanning electron microscope （SEM）. The results showed that there were number of imprinted micropores on the surface of MIM. The sensor showed high selectivity and specificity towards the target ractopamine. The response of the sensor to concentration of ractopamine displayed a linear correlation over a range from 0.33 to 8.0 mg/L with a detection limit of 0.033 mg/L. The recoveries were 91%－98% based on pig urine samples for the determination of ractopamine on sites.

Keywords Multiwalled carbon nanotubes; Ractopamine; Molecularly imprinted membrane; Conductometric sensor

（Received 18 April 2011; accepted 6 September 2011）