納米纖維固相萃取柱萃取-高效液相熒光法分析頭發皮質醇

摘 要 采用基于納米纖維固相萃取的高效液相色譜熒光測定 （HPLCFlu） 法測定頭發中的皮質醇水平。以新型納米纖維萃取柱（PFSPE）提取頭發樣本浸出液，用100 L甲醇直接洗脫后注入色譜體系進行分析。此方法的檢出限為0.05 ng/g（S/N＝3），日內精密度和日間精密度分別低于6.8%和8.9%，平均方法回收率為88.9%。本方法提取過程簡便、快速、環保，而且可以準確測定頭發樣本中的皮質醇水平。

關鍵詞 納米纖維；頭發； 皮質醇；皮質酮；高效液相色譜； 熒光檢測

1 引 言

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在精神生物學研究中，皮質醇（嚙齒類動物是皮質酮）是一種非常重要的激素，它被稱為“壓力荷爾蒙”，人體面臨生理、心理刺激時，其分泌量增高（應激反應）^[1]。目前研究中采用的血液、唾液、尿液等樣本測試皮質醇的水平，只能反映應激及時變化或一定時間內的累積情況。而對于研究對象一段時間（數月以上）的應激情況進行了解，就可以采用頭發這種生物樣本。研究證實，頭發能夠反映人體長期的攝藥信息（可以追溯到幾個月之前），頭發皮質醇是一種很好的研究長期下丘腦垂體腎上腺軸（HPA軸）活性的工具，可以客觀測量慢性應激^[2]。Pereg等^[3]指出，在諸多心梗發病征兆中，頭發的皮質醇水平是判斷發病風險最明顯的生物學標志物。采用頭發基質，對于分析測試具有很多優勢，如頭發生長規律，為研究者提供一種追溯性研究窗口；頭發采樣無創、簡便、無需專業指導；頭發樣本可以室溫儲存等^[2]。頭發皮質醇分析將成為生理學、精神醫學、體育醫學、認知科學、心理學等眾多學科的重要研究手段。 

目前，頭發中皮質醇測定多采用放射免疫法^[4]、酶聯免疫法^[5]及LCMS法^[6]。免疫法靈敏度較高，能夠檢測出頭發中的痕量皮質醇，但存在交叉反應、測定結果偏高。各種商業性的免疫試劑盒測定的結果差異性較高，試劑盒的成本也較昂貴。LCMS法雖然準確靈敏，但需要昂貴的儀器，故一般實驗室難以普及。此外，還有HPLCFlu法測定頭發中皮質醇分布的報道^[7]，采用傳統SPE和溶劑萃取的方法分別提取頭發浸出液和硫酸衍生產物。本研究優化改進了頭發樣本前處理操作，用本研究組建立的基于電紡納米纖維的固相萃取技術（Packedfiber solidphase extraction， PFSPE）^[8，9] 取代文獻方法SPE和溶劑萃取步驟，省略了揮發提取溶劑濃縮目標物的操作，使熱不穩定的目標物提取效率大大提高，同時使前處理操作時間大大縮短、操作更為簡便，實現了頭發中皮質醇的高效靈敏檢測。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC20AD高效液相色譜儀、RF10AXL熒光檢測器、SIL20AC自動進樣器、CTO20A柱溫箱均購自日本島津公司；DDSPH計（上海理達儀器廠）、離心機（無錫瑞江公司）；XW80A漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）； AL104IC分析天平（METTLER TOLEDO）； MM 400冷凍混合型球磨儀（德國萊馳公司）；HY2調速多用振蕩器（常州國華電器有限公司）；XWy01型納米纖維固相萃取柱（蘇州先偉納米技術有限公司）。

皮質醇（又名氫化可的松）和皮質酮標準品購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純， 山東禹王化學品公司），H2SO4、乙醇等其它試劑分析純。實驗用水為重蒸去離子水。