體外大鼠腸道菌群代謝脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的研究

摘 要 運用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿/飛行時間質(zhì)譜（UPLCQ/TOFMS）識別和確定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynialenol， DON）在大鼠腸道菌群體外代謝模型中的代謝產(chǎn)物，同時運用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜定量分析DON含量變化，比較各段腸管中厭氧菌群的代謝能力。結(jié)果表明，DON不能被大鼠小腸菌群代謝，而能被其大腸菌群代謝為脫環(huán)氧代謝產(chǎn)物脫環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deepoxydeoxynialenol， DOM）。定量測定結(jié)果顯示，大腸中盲腸菌群代謝能力最強。

關(guān)鍵詞 體外代謝； 腸道菌； 大鼠； 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇； 超高效液相色譜串聯(lián)四級桿/飛行時間質(zhì)譜

1 引 言 

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynialenol， DON），化學(xué)名為3α，7α，15三羥基12，13環(huán)氧單端孢霉9烯8酮，俗稱嘔吐毒素，屬于B型單端孢霉烯醇類毒素。DON是由鐮刀菌屬中的禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物^[1，2]。DON能夠引起動物增重下降、食欲減退、營養(yǎng)吸收率降低、嘔吐等慢性毒性作用；對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞均具有明顯的細(xì)胞毒性；DON能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，同時還影響免疫細(xì)胞因子的分泌^[3]。通常，毒性物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后毒性會降低，然而有時生物轉(zhuǎn)化后會形成毒性增強的代謝產(chǎn)物。

利用氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）已研究DON多種動物模型，但僅識別和鑒定出一種Ⅰ相代謝產(chǎn)物脫環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deepoxydeoxynialenol， DOM）^[4～8]。眾所周知，在代謝產(chǎn)物研究中液相色譜質(zhì)譜（LCMS）已成為最合適、最有效的分析方法^[9]。本研究運用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿/飛行時間質(zhì)譜（UPLCQ/TOFMS）分析DON在大鼠腸道厭氧菌群體外代謝模型中代謝產(chǎn)物，同時利用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（LCMS/MS）比較各段腸管代謝能力的強弱。UPLCQ/TOFMS結(jié)合了超高效液相色譜提供的更快、更靈敏的色譜分離能力和四級桿飛行時間質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)測定優(yōu)勢^[9～11]，借助代謝產(chǎn)物識別軟件MetabolynxXS自動分析采集樣品信息，特別是質(zhì)量缺失過濾（Mass defect filter， MDF）的應(yīng)用能有效剔除假陽性結(jié)果，從而提高分析效率^[12，13]。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與動物

ACQUITYTM超高效液相色譜（配Acquity BEH C18 色譜柱），Alliance 2690高效液相色譜（配Symmetry RP C18色譜柱），SYNAPTTM四級桿飛行時間質(zhì)譜（美國Waters公司）；Quattro三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（英國Micromass公司）；BactroⅢ厭氧培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；Allegra64R臺式高速離心機（美國Becrman公司）；氮吹儀 （美國Organomation Associates公司）；旋渦混合器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）。

DON標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，以色列Fermentek公司），乙酸乙酯（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）， 乙腈（農(nóng)殘級，美國Fisher公司），氨水（28%，美國AlfaAesar公司），厭氧培養(yǎng)基（北京陸橋有限責(zé)任公司），超純水由MilliQ純水儀（美國Millipore公司）自制。

Wistar大鼠（體重220～250 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），禁食12 h，自由飲水。

2.3 實驗方法

2.3.1 大鼠腸道厭氧菌群培養(yǎng)液制備 大鼠脫椎致死后迅速打開腹腔， 分離腸管，轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱中。在培養(yǎng)箱中取出腸道內(nèi)容物，按1∶15（m/V）比例加入?yún)捬跖囵B(yǎng)基溶液，用四層紗布過濾獲得厭氧菌群培養(yǎng)液。

2.3.2 DON在厭氧菌群中孵育條件 厭氧培養(yǎng)箱中混合氣組成為5% H2，5% CO2 和90% N2。培養(yǎng)溫度設(shè)為37 ℃。10 L。ESI負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；霧化氣（N2）流速：30 L/h；脫溶劑氣（N2）流速：600 L/h; 碰撞氣： 氬氣； 采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）測定DON及其代謝物含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 DON質(zhì)譜分析

DON樣品MS/MS掃描結(jié)果見圖1。表1給出了DON碎片離子的元素組成、碎片離子測量值、計算值、測量誤差和雙鍵不飽和值（DBE）。

測量誤差在－0.0060～0.0056 Da范圍內(nèi)，表明質(zhì)量數(shù)測量較為準(zhǔn)確，可以利用儀器自帶軟件推導(dǎo)得出各個離子的元素組成，獲得各個離子的結(jié)構(gòu)。

圖1 DON精確MS/MS質(zhì)譜圖譜

Fig．1 Accurate MS/MS spectra of deoxynivalenol（DON）

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如圖1所示，DON分子離子m/z 295，失去一分子H2O形成碎片離子m/z 277，或失去CH2O形成主要的碎片離子m/z 265。碎片離子m/z 65 和277分別失去H2O和CH2O形成碎片離子m/z 247。碎片離子m/z 247失去一分子H2O形成碎片離子m/z 229，或失去CH2O形成碎片離子m/z 217。DON可能的裂解途徑見圖解1。

3.2 代謝物識別 

通過MetabolynxXS軟件比較陽性樣品和空白對照樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖，推斷DON可能的代謝產(chǎn)物。在大腸厭氧菌群孵化液中發(fā)現(xiàn)一種代謝物，而小腸厭氧菌群孵化液中未發(fā)現(xiàn)DON代謝物存在。識

別的代謝物色譜保留時間為1.97 min，代謝物分子離子質(zhì)量數(shù)為279， 如圖2所示。 對可能的代謝物進行MS/MS掃描，鑒定代謝物的結(jié)構(gòu)。 精確MS/MS質(zhì)譜圖如圖3所示，代謝物分子離子m/z 279和碎片離子m/z 261， 249， 231和213，比DON分子離子m/z 295 和碎片離子m/z 277， 265， 247 和 229均少16 Da，暗示DON可能失去一個環(huán)氧原子，形成脫環(huán)氧DON。雖然應(yīng)用了更好的色譜分離系統(tǒng)以及測量精度更高的質(zhì)譜測量技術(shù)，同時借助藥物代謝軟件的自動分析手段，但仍未發(fā)現(xiàn)新的代謝產(chǎn)物，推測

圖2 大鼠腸道孵育液DOM精確的MS/MS色譜圖：A為大腸孵育液陽性樣品；B為大腸孵育液空白對照；C為小腸孵育液陽性樣品；D為小腸孵育液空白對照

Fig．2 Accurate MS/MS chromatogram of deepoxydeoxynivalenol （DOM）1 by intestinal microflora of rats: A is the sample of culture media of large intestine， B is the control of large intestine; C is the sample of culture media of small intestine， D is the control of small intestine3.4 腸道厭氧菌群代謝能力

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胃腸道是異物入侵動物機體的主要路徑，因此腸道微生物在真菌毒素的轉(zhuǎn)化消除中起著重要的作用。如圖2所示，在小腸厭氧菌群孵化液中未發(fā)現(xiàn)DOM存在，在大腸厭氧菌群孵化液中能夠檢測出DOM的存在，保留時間為1.97 min，可見大腸微生物對DON有轉(zhuǎn)化能力。測定不同時間孵育后盲腸、結(jié)腸和直腸厭氧菌群孵化液中DON含量，比較大腸不同部位對DON代謝能力的強弱。如圖4所示，盲腸孵育液中DON的含量隨著時間的推移，呈逐漸降低趨勢，經(jīng)過24 h孵育幾乎完全被轉(zhuǎn)化成DOM。從圖5可見，盲腸孵化液中DOM的含量遠(yuǎn)高于結(jié)腸和直腸孵化液中DOM的含量。由此可見，大腸各部分腸管中，盲腸對DON的代謝能力高于結(jié)腸和直腸部分。