1.9 ?分辨率μ-crystallin蛋白晶體結構及其酮亞胺還原酶活性位點分析

許新磊 李 健 孫麗華 徐春艷 何建華

(中國科學院上海應用物理研究所 上海 201800)

3, 5, 3′-三碘-L-甲腺原氨酸(T3)在細胞分化、新陳代謝過程中發揮著重要作用。甲狀腺分泌的 T3通過主動轉運進入細胞[1]，在細胞質中與結合蛋白結合，經過轉運蛋白進入細胞并與細胞核受體作用，調控特定基因的轉錄[2,3]。Hamada等[4]證明了細胞質可溶部分中存在特異的T3結合蛋白。Kobayashi等[5]從鼠肝臟純化的細胞質蛋白 CTBP具有依賴NADPH的T3結合活性。Vie等[6,7]通過蛋白質序列分析證實人源 CTBP(p38CTBP)為 μ-crystallin (CRYM)。CRYM為種屬特異性蛋白，尤其在袋鼠晶狀體中大量表達[8]，亦在人視網膜、腦、心臟、腎臟表達。

CRYM具有將 T3保持在細胞內的作用[9]。現已報道與nonsyndromic deafness有關的CRYM基因的兩種突變—K314T和X315Y[10]，K314T突變被確認失去了T3結合能力[11]。CRYM在面肩胛肱肌營養不良癥(FSHD)病人肌肉中大量表達，FSHD常伴隨視網膜脈管異常，聽力喪失、心律不齊，表明CRYM具有影響分化和氧化應激反應的功能[12]。CRYM 在內毒素誘導的葡萄膜炎中具有次要的作用并在人前列腺癌受雄激素調控高表達[13,14]。Hallen等[15]通過MS/MS確認哺乳動物前腦酮亞胺還原酶為 μ-crystallin，并具有酮亞胺還原酶活性，含硫環形酮亞胺具有影響神經功能的生物學活性[16]。結果表明CRYM除了具有NADPH依賴的甲狀腺素結合能力，更有可能通過其酮亞胺還原酶活性調節 T3以及其他小分子的活性，進而影響多種生理進程。

μ-crystallin與NADPH復合物(2.6 ?分辨率)的晶體結構已經解析[17]，我們用不同結晶條件結晶了μ-crystallin，在上海光源采集1.9 ?分辨率數據。分析了2I99結構與同源結構OCD /AlaDH的差異，以及酮亞胺還原酶的活性位點，加深了對CRYM結構與功能的認識。

1 材料與方法

1.1 μ-crystallin的表達純化

蛋白表達與純化參照文獻[17]方法并加以改進，通過PCR從人腦cDNA庫中克隆CRYM cDNA，構建pET22b(+) (Novagen)，純化的質粒轉化大腸桿菌BL 21(DE3)細胞(Stratagene)。挑取單克隆，50 mL LB培養基加入終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素，37°C、250 r/min培養10 h。轉入750 mL LB培養基，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，37°C、250 r/min擴大培養，至OD 600為0.6–0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，30°C，200 r/min誘導表達，5 h后收集細菌(6000 r/min、10 min、4°C)。沉淀的細菌用buffer A(20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.5，200 mmol/L NaCl，5% glycerol)重懸，使用細胞壓力破碎儀破碎。細菌破碎后離心(30000 g、30 min、4°C)，收集上清。用buffer A平衡5 mL HisTrap HP親和柱(GE Healthcare)，加上清后使用FPLC洗脫，先用buffer A沖洗，然后用30% buffer B (20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.5，200 mmol/L NaCl，5%甘油，300 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白質。收集洗脫峰處的蛋白質后用10 kD的超濾管(Millipore)濃縮。進一步純化使用分子篩(120 mL HiLoad Superdex75 16/60 column，GE Healthcare)，用 buffer C預先平衡(20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.5，150 mmol/L NaCl，5% glycerol)，收集洗脫峰處蛋白質并濃縮至20 mg/mL，–80°C冷藏備用。

1.2 μ-crystallin晶體衍射數據收集及結構解析

采用氣相擴散法結晶，μ-crystallin蛋白濃度為20 mg/mL，池液為 0.2 mol/L硫酸銨，0.1 mol/L Bis-Tris pH 6.0，20% PEG3350，1 μL蛋白質加入1 μL池液，4°C靜置。

晶體衍射數據收集時防凍劑采用0.2 mol/L 硫酸銨、0.1 mol/L Bis-Tris pH 6.0、20% PEG3350、20%(V/V)甘油，撈取晶體后用液氮冷凍保存。在上海同步輻射裝置(SSRF)生物大分子線站(BL17U1)收集衍射數據，溫度 100 K，探測器使用 ADSC Q315r CCD。收集的衍射數據用HKL-2000[18]軟件包進行初步處理，采用PHENIX[19]進行相位解析和結構修正，用COOT[20]進行調圖，CRYM晶體數據及結構修正參數見表 1，表中括號內數字表示最外殼層的相應數值。

表1 人源CRYM數據收集與修正參數Table 1 Statistics for data collection and refinement of human CRYM.

2 結果與討論

2.1 CRYM晶體結構

人源 CRYM晶體結構一個不對稱單位由兩個蛋白質分子組成，最終模型包括A鏈A2-A313、B鏈B4-B312，139個水分子，兩個NADPH，其中B鏈缺少了81-89位殘基的電子密度，CYRM與2I99結構疊合的 RMSD值為 0.78778 ?。人源CRYM結構可分為二聚化結構域和NADPH結合結構域，二聚化結構域包括殘基2-112和296-312。折疊為6個反平行β折疊，3個α螺旋，2個310螺旋，與2I99相比少一個短的β折疊和一個310螺旋，但在βC與βD之間多一個310螺旋(圖1a和圖1b分別為1.9 ?和2.6 ?分辨率的人源CRYM單體結構，輔因子NADPH以棍狀表示，兩個結構的不同之處用圓圈標出，圖使用PyMOL[21]產生)。結構二聚化結構域的疏水面為二聚化面，另一面包含R47、K75、S91、H92、R119和D299等多個極性殘基。這些殘基在CRYM家族中均為保守殘基(圖2中蛋白質序列分別來源于Homo sapiens(human), Bostaurus (bovine), Musmusculus(mouse), Macropus fuliginosus (Westerngraykangaroo), Xenopuslaevis (Africanclawedfrog)，鳥氨酸環化脫氨酶(OCD, Archaeoglobusfulgidus)和丙氨酸脫氫酶(AlaDH, Pseudomonasputida)。SWISS-PROT數據庫中的訪問號分別是Q14894、Q2KHX6、O54983、Q28488、Q66KY1、O28608和Q88H32。CRYM的二級結構通過軟件 DSSP[22]分析得出，指示在該序列比對的上方。CRYM與AlaDH和OCD分別有30%–40%的序列相似性，相同的氨基酸深色標示。酮亞胺酶可能的底物結合位點和催化位點分別用黑色圓形和方塊表示。該序列比對使用軟件 ClustalW[23]和ESPript[24]生成。

CRYM單體中各有一個NADPH，純化及結晶過程中沒有添加NADP，但是，解析結構中依然可看到清晰而完整的 NADP電子密度(圖 3)。說明NADPH在CRYM功能發揮即與T3的結合及其發揮酮亞胺還原酶的活性中起著重要作用。

NADPH結合結構域包含殘基113-295，折疊為一個Rossmann花樣，而此折疊樣式在NAD/NADP結合蛋白經常出現[25]。與其他二核苷酸結合蛋白結合相同，CRYM通過βG與α4之間的Gly富集區與NADPH的焦磷酸部分結合，序列為GAGVQA-(143-148位殘基)。焦磷酸部分與V146和Q147主鏈酰胺形成氫鍵(圖4用LIGPLOT[26]產生，其中氫鍵以虛線表示，與NADPH形成疏水作用的殘基以穗狀表示)。Q147在所有μ-cystallin序列中均為保守殘基，可能由于其側鏈酰胺基與焦磷酸部分相互作用。位于loopEF上的S91同樣與焦磷酸部分有氫鍵作用，同其他Rossmann折疊一樣，有一保守水分子介導了G145主鏈酰胺N與V204主鏈羧基O的相互作用[27]。 R169側鏈與腺嘌呤環平行，腺嘌呤與D82、T205和A207形成疏水相互作用，D82、 R169、T205、L206和A207共同作用將NADPH腺嘌呤部分固定，N168、R169、N173與腺嘌呤核糖2′-磷酸基團形成氫鍵，此結構域相較 2I99少了兩個β折疊。通過結構看到，兩個結構的不同之處均出現在CRYM結構的外側(圖1)，而不同處的氨基酸序列未顯示保守性，未對整體結構產生大的影響。

圖1 1.9 ?人源CRYM與輔因子NADPH的晶體結構與2I99比較Fig.1 Comparison of crystal structure of human CRYM in 1.9 ? with 2I99.

圖2 不同來源CRYM蛋白質以及OCD、AlaDH氨基酸序列比較Fig.2 Multiple sequence alignments of the μ-crystallin family.

圖3 NADPH電子密度圖(2F0-FC)Fig.3 Electron density maps (2F0-FC) of the bound NADPH.

2.2 CRYM酮亞胺還原酶活性位點分析

酮亞胺還原酶是以NADH或NADPH為輔因子特異性的還原亞胺鍵的還原酶。酮亞胺還原酶底物為環亞胺(AECK、P2C、Pyr2C)，NADH/NADPH作為質子供體，通過酸堿催化將C4上的質子轉移到酮亞胺不飽和鍵上[28]，將亞胺還原(圖5a，NADH/ NADPH依賴的酮亞胺還原酶催化的底物類型，AECK、TMA、P2C、L-PA、Pyr2C、L-Pro)。CRYM同源物P.putida OCD(PpOCD)以NADH為輔因子催化L-鳥氨酸轉化為L-脯氨酸，這一反應的亞胺中間體[29](Pyr2C)與酮亞胺還原酶底物相同(圖5b，鳥氨酸環化脫氨酶催化鳥氨酸環化脫氨的立體化學反應機制)。由于CRYM和PpOCD底物結構具有很高的相似性，由此我們對CRYM酮亞胺還原酶活性位點進行了推測。

根據CRYM與NADPH間的相互作用對與NADPH相關的保守氨基酸進行了分析，由圖4看出，NADPH煙酰胺部分酰胺極性原子與S292、R119形成氫鍵，S292、R119在μ-crystallin/OCD家族中是識別NADPH煙酰胺部分的保守氨基酸；μcrystallin中T120羥基氧與煙酰胺C4(3.2?)、T116羥基氧(2.7?)以及R119 NH1(2.9?)形成四面體相互作用，同源結構AlaDH的NAD結合中T109羥基氧與煙酰胺C4、T105羥基氧以及R108 NH1形成四面體相互作用[30]，同源的PpOCD的NAD結合中T113羥基氧與煙酰胺C4、T109羥基氧和R112 NH1也形成四面體相互作用[29]。說明μ-cystallin家族中保守殘基T116、R119和 T120可很好定位煙酰胺C4(圖 6a，NADPH煙酰胺環 C4周圍的殘基，C4用星號標出)。NADPH煙酰胺Pro-R面與二聚化結構域之間形成空腔，在空腔對面存在多個殘基側鏈--R47、M62、K75、V77、F79、H92、S229、K291、 L293、D299(圖6a)。這些殘基中，除S229和L293為半保守殘基外，其余均為完全保守殘基。

圖4 人源CRYM與輔因子NADPH相互作用示意圖Fig.4 Schematic diagrams of interaction between human CRYM and NADPH.

圖5 酮亞胺還原酶催化反應與PpOCD催化反應對比Fig.5 Comparison of the reaction catalyzed by ketimine reductase and PpOCD.

圖6 CRYM中NADPH周邊殘基及酮亞胺還原酶活性位點Fig.6 A stereo diagram of residues surrounding the NADPH of CRYM.

在脫氫酶中，底物羧基通常與一個保守的Arg(或者Lys)相互作用[30]。PpOCD中，鳥氨酸羧基與 R45、K69和 R112相互作用，這三個殘基在CRYM中為保守殘基(R47、K75、R119)。所以，CRYM中的酮亞胺羧基可能如同PpOCD中一樣與R47、K75、R119三個殘基形成鹽橋(圖6b，推測的CRYM結合Pyr2C可能的活性位點，活性殘基下方以橫線標出)，我們推測R47、K75和R119為CRYM酮亞胺還原酶結合位點。這與T3結合位點相同[17]，說明T3能夠可逆的競爭性抑制酮亞胺酶活性。

NAD或NADPH依賴的酶催化活性位點需要作為質子受體或供體的殘基，以實現輔因子和底物之間的氫轉移[31,32]，如組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，在還原反應中通常出現的廣義酸殘基為組氨酸[28]。通過序列對比可以看到，PpOCD中，催化L-鳥氨酸轉化為 L-脯氨酸的活性殘基 D228、E56，在CRYM中對應位置為S229和G60，而這兩個殘基均非酸堿催化殘基。AlaDH中催化L-Ala分解為丙酮酸鹽與氨的活性殘基K41、R52、K65，在CRYM中被R47、G60、K75取代，G60取代R52破壞了AlaDH中質子傳遞鏈，并且在AlaDH起催化作用的兩個重要水分子在CRYM中并未出現。因此我們認為R47、G60、K75和S229并非CRYM酮亞胺還原酶的催化活性位點。

?1-Piperideine-2-carboxylate/?1-Pyrroline-2-carb oxylate Reductase中H54、S53和D194形成酮亞胺還原酶活位點[28]。通過序列比對和結構分析，我們認為在μ-crystallin家族中保守的H92最有可能作為催化殘基。H92與煙酰胺C4相距6.0?，S91與H92相距2.7?，D82與S91相距8.1?，這三個殘基極有可能參與酮亞胺還原反應的質子轉移過程，所以我們推測D82、S91和H92為CRYM酮亞胺還原酶催化活性位點。

2.3 CRYM B鏈81-89位殘基缺失與其底物結合關系

與2I99結構對比，在分辨率更高的情況下，未能捕捉到B鏈81-89位殘基的電子密度，我們推測可能是由于loopEF的柔性，在不同的結晶條件中堆積不同造成的。2I99結構中Pro90在AB鏈具有不同的構象，A鏈中為順式構象，而B鏈為反式構象，高的b-factor說明其具有很高的柔性。D82、S91、H92處于loopEF上，loopEF的柔性可能與其酮亞胺還原酶功能發揮有關。由于loopEF的缺失，結構中出現兩個明顯的空腔入口(圖7a，1.9 ?分辨率人源CRYM的B鏈81-89殘基處表面結構)，而在2I99只有一個空腔，NADPH結合在此空腔(圖7b，2I99結構B鏈81-89位殘基處表面結構)。CRYM中出現的空腔1即為輔因子NADPH結合位點，空腔2可能為底物結合位點，其中 R47、G60、K75位于空腔2底部。我們推測loopEF的柔性可能與CRYM底物選擇性有關。

圖7 1.9 ?人源CRYM B鏈NADPH結合結構域表面結構與2I99對比Fig.7 Comparison of the NADPH binding domain of the CRYM chain B in 1.9 ? with 2I99.

3 結語

CRYM在體內具有調節甲狀腺素的重要作用，在多種神經病癥中表達量有所改變[10,12]，其酮亞胺還原酶活性具有改變甲狀腺素在細胞的濃度以及調節激素的功能。酮亞胺還原酶作為參與氨基酸代謝的酶類，揭示CRYM在生物體內具有多重作用。CRYM酮亞胺還原酶底物、酶活位點及其調節甲狀腺素生理功能的機制有待進一步研究。

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