腸三葉因子對腸黏膜保護與修復的研究

章美元 綜述 韓 真* 審校

皖南醫學院附屬弋磯山醫院消化內科（241001）

三葉因子家族是近年研究較多的一群小分子多肽，具有黏膜保護、修復、抑制炎癥介質反應、調節細胞免疫和細胞凋亡等功能。目前已發現3種三葉肽，即乳癌相關肽（pS2/TFF1）、解痙多肽（SP/TFF2）和腸三葉因子（ITF/TFF3）。 其中ITF于1991年由Suemori等[1]首次在大鼠空腸發現，其既是腸道特異性黏膜修復因子，又是黏膜損傷的快速反應肽。本文就ITF對腸黏膜保護與修復的研究作一綜述。

一、ITF的結構特點和性質

ITF主要是由杯狀細胞分泌的特異分布于腸黏膜表面的多肽物質。人ITF編碼基因定位于21號染色體長臂（21q22.3）長度為55 kb的片段中，并可連鎖表達[2]。ITF為含有59個氨基酸的單鏈多肽，分子質量為6～7 kDa（1 Da=0.9921 u），同源序列約有38～39個氨基酸，包括保守和半保守的氨基酸。保守氨基酸中包含6個半胱氨酸殘基，形成三個鏈內二硫鍵，交聯方式為1-5、2-4、3-6，從而產生特征性三葉結構。ITF的結構保守，具有抗酸、抗蛋白酶和抗熱分解等特性。

ITF分布有較強的組織特異性和細胞特異性[3]。ITF主要在小腸、結腸和胃竇黏膜[4]中高表達，各段小腸中ITF含量差異不明顯[5]。近來研究發現人食管黏膜下腺體（主要在Z線和胃賁門之間）可見ITF較高表達，在胰腺、唾液腺、淚腺、鼻黏膜、前列腺、子宮、乳腺、氣管、肺、下丘腦、垂體、海馬回[6]等組織中亦有低水平表達，此外ITF亦可在乳汁中表達，胎兒出生前后ITF表達不同[7,8]。

在病理狀態下，ITF表達發生明顯改變，分布缺乏組織專一性，在食管腸化生、胃食管反流病、胃潰瘍、腸道慢性炎癥以及腺瘤、腺癌等中均有表達。Kadri等[9]發現ITF在Barrett食管（BE）而非鄰近組織中高表達，有望成為BE非內鏡檢查的標記物。ITF表達與結腸腫瘤預后相關，其表達增高提示預后不良[10]。ITF在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和肝癌組織中亦有表達。Vestergaard等[11]報道前列腺癌患者血漿ITF濃度增加，但其是否可作為預測前列腺癌的指標，仍需進一步研究證實。ITF在肝細胞癌組織中高表達，并與肝細胞癌分級有關[12]。ITF在腫瘤中的高表達與其功能密切相關，同時進一步證明TFF的生理作用是一個復雜的調控過程。

二、ITF的黏膜保護機制

1.與黏蛋白的結合：整個胃腸道不斷受到各種理化、生物因素的侵襲，需一套有效的機制來維護黏膜完整性并及時修復損傷的黏膜。ITF和黏蛋白由相同的杯狀細胞產生，損傷發生時兩者的表達同時上調。研究發現ITF與黏蛋白結合時保護作用增強[13]。ITF分子的空間結構中有一大小為0.8～1 pm的間隙能特異性地與黏蛋白的側鏈結合，對黏蛋白的分子結構起支架作用，且其結合位點可隨黏蛋白的側鏈不同而進行調整。兩者結合后，形成凝膠復合物，起穩定黏液層的作用，能阻止多種蛋白酶以及機械應力等因素造成的腸黏膜損傷。此外，兩者之間還存在互相作用的機制，如黏蛋白可使腸上皮細胞表面ITF結合蛋白表達上調從而促進ITF與腸上皮細胞的結合[14]。ITF可通過二硫鍵與黏蛋白相互交聯，形成黏彈性的黏液凝膠層，且在應用ITF后明顯增加可溶性黏液的分泌量并增加其黏度。實驗[15]證實ITF具有保護黏膜的作用，其對黏膜保護作用的機制為穩定黏液層以及刺激上皮細胞在損傷處的修復[16]。

2.參與調節免疫反應，降低炎癥反應：ITF不僅參與黏液屏障的組成，還通過阻止腸道炎癥反應來保護胃腸黏膜。研究[17]報道ITF通過抑制單核細胞iNOS/NO調節結腸炎NO介導的炎癥反應。Teng等[18]給予結腸炎小鼠注射rhITF，結果顯示腸道損害減輕，炎癥介質腫瘤壞死因子（TNF）-α、Toll樣受體 4（TLR4）、NF-κB表達降低，其機制可能為 ITF可阻斷TLR4/NF-κB信號通路。盡管ITF在免疫反應中起一定作用，其并不是直接通過樹突細胞來調節由脂多糖（LPS）介導的免疫反應[19]，具體的調節機制仍有待進一步研究。

3.抗細胞凋亡作用：ITF抗凋亡信號系統目前尚不完全清楚。細胞凋亡對確保正常發育、生長以及維持內環境穩定有重要的作用，凋亡過程由復雜的基因網絡所調控，并受到相關細胞因子影響。目前認為凋亡主要有兩條調節途徑：①線粒體通路（內源性途徑）：該通路的活化由促凋亡因子如BAX和BAK以及抑制因子Bcl-2和Bcl-xl之間的平衡所調節，p53是這一過程重要的調節分子；②細胞表面死亡受體通路（外源性途徑）：細胞表面的蛋白質與攜帶凋亡信號的專一性配體結合，誘導細胞凋亡，如Fas/FasL凋亡途徑。上述兩條通路最終均激活caspase，進而執行細胞凋亡。Taupin等[20]的實驗發現ITF缺失小鼠的結腸細胞凋亡增加且不伴隨Fas或Bcl家族表達的改變；高表達ITF的結腸細胞株（HT-ITF1）能抵抗由神經酰胺和血清饑餓誘發的細胞凋亡；外源性ITF可保護人結腸腫瘤細胞株HCT-116和IEC-6細胞凋亡；且這種作用可被酪氨酸磷酸化抑制劑A25所抑制，提示其可能與磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和表皮生長因子受體（EGFR）活化有關。AGS胃癌細胞中p53依賴的細胞凋亡可被C末端未發生剪切突變的ITF所抑制，且PI3K和EGFR須功能良好。由此可見，ITF是內源性胃腸道具有抗凋亡特性的肽類物質。ITF能促進IEC-18細胞[21]和SW837結腸癌細胞[22]中轉染表達人類ITF載體NF-κB p50/p65異源二聚體的活性，且能增強IEC-18細胞的抗凋亡能力，此外，NF-κB阻斷劑能顯著降低ITF誘導的IEC-18細胞的抗凋亡能力，推測ITF能通過NF-κB途徑增強IEC-18的抗凋亡能力。ITF的抗凋亡作用可能是其在腫瘤和IBD等疾病中的重要作用機制之一，需進一步研究探討。

三、ITF的黏膜修復機制

1.促進腸上皮細胞移行：黏膜上皮細胞損傷后早期修復的關鍵環節是細胞遷移，即損傷區域周邊的細胞遷移到損傷區，重建上皮的完整性并重組黏膜屏障[15,23]。上皮細胞間通過位于側膜上的連接復合體而相互黏附，這種連接復合體由三種咬合在一起的成分組成：緊密連接、黏附連接以及橋粒[24,25]。緊密連接由多種蛋白質參與形成，主要包括閉鎖蛋白（occludin）、閉合蛋白（claudin）、閉鎖小帶（zona occludens,ZO）、連接黏附分子等。黏附連接發生在相鄰細胞的鈣黏蛋白（cadherin）分子之間，由Ca2+介導。如緊密連接或黏附連接等發生破壞或功能改變，即發生細胞遷移。ITF在體內外均能促進多種細胞的遷移，可能與 APC蛋白、β-catenin、E-cadherin、EGFR復合體、ERK等關系密切。研究[26]發現細胞因子和生長因子促進腸黏膜的修復需轉化生長因子（TGF）-β介導，而ITF對上皮的修復作用不依賴TGF-β，其通過促進損傷周圍細胞遷移到破損處進行精密修復。ITF通過上皮細胞cadherin降低細胞間連接，促進細胞移行。上皮細胞cadherin是相對分子質量為12000的跨膜蛋白，其細胞外部分介導細胞間的緊密連接，細胞內部分通過catenin與細胞骨架的微絲系統相連。ITF通過影響上皮細胞間catenin的表達和定位，以及誘導catenin的酪氨酸磷酸化，從而降低細胞間的緊密連接，促進上皮細胞移行。ITF促進腸上皮細胞移行還涉及Ras信號轉導途徑，并與EGF信號轉導途徑密切相關。ITF可能通過酪氨酸或雙異磷酸酶活性調節細胞內信息通道，抑制ERK和MAPK的部分通道。ITF可直接刺激ERK磷酸化，而不經EGF受體磷酸化，既不需要完整的三葉基序，又無需二聚化而可完成促進細胞移行的作用。目前對ITF是否促進上皮細胞分化尚不清楚。有研究[13]表明ITF的修復作用需杯狀細胞的分化、成熟以及其與黏蛋白的組裝和分泌。

目前ITF介導修復的具體信號轉導通路尚未完全清楚。Kalabis等[27]通過質譜分析發現Vangl1在接受ITF刺激后發生Ser/Thr磷酸化，減少了細胞膜間E-cadherin的連接，促進小腸上皮細胞的創傷愈合。因而Vangl1可能是介導ITF修復小腸黏膜的效應器。

2.促進血管增殖，與EGF協同增效：黏膜重建還需豐富的黏膜血流供應，ITF和其他相關生長因子可促進血管生成[28]，從而促進黏膜修復。ITF與EGF在多種損傷模型中發揮協同增效的作用，EGF引起的離子遷移亦有調節作用。在各種不同的細胞株中，給予ITF后，EGF受體和ErbB-2發生磷酸化[29]。目前尚未證實ITF與EGFR有直接的聯系，推測EGFR可能發生一種間接的轉活。

3.與受體作用，促進細胞增殖：ITF可能通過與其受體結合來發揮修復黏膜的功能。動物實驗[30]中小劑量皮下給藥即可顯示ITF的保護功能，說明可能存在三葉肽特異性受體或轉運蛋白。但目前尚缺乏明確的證據。有研究[31]推測PDZD2可能與ITF密切相關，其受體可能是具有PDZ結構域或類似PDZ結構域的一種新蛋白。ITF與PDZD結合后，使PDZD2蛋白構象發生改變，暴露PDZ結構域，從而與Vangl1結合，通過Ser/Thr磷酸化，使其失去結合Dsh的能力，解除Vangl1對Dsh的抑制作用，從而使Wnt信號能順利向下游傳遞，發揮促細胞移行的作用。Wnt8b、ITIH4可能是ITF受體的候選蛋白，有待進一步篩選研究。

四、ITF與IBD關系

IBD病因不明確，可能與遺傳、環境、感染和免疫均有關，細胞因子參與免疫反應和炎癥過程，是當前研究IBD發病機制的熱點之一。TNF-α等細胞因子在IBD發病中的作用已得到公認，但其釋放和調控機制尚不明確，近年集中于TLRs/NF-κB通路，而研究[17]表明ITF可阻斷該通路，且外源性給予、局部給予和促內源性增加ITF，均能使黏膜凝膠的穩定性提高，促進黏膜損傷愈合，加快修復。ITF的促進黏膜愈合作用[32]，可能使其成為治療IBD的新方案。

五、結語

ITF作為一種新的胃腸黏膜保護因子，目前其作用受到廣泛重視。其既能與黏蛋白結合形成凝膠，增強黏膜防御功能，促進腸上皮細胞移行，加速損傷修復，保持腸黏膜完整，從而減輕電解質丟失和免疫所致的腸道炎癥反應；同時有具有抗酸、耐酶以及熱分解的生物學特性，從而有望成為預防和治療IBD的一種新途徑。但目前仍應進一步闡明ITF多肽分子的功能，鑒定其受體或結合蛋白，并闡明各級信號通路。

1 Suemori S, Lynch-Devaney K, Podolsky DK.Identification and characterization of rat intestinal trefoil factor:tissue-and cell-specific member of the trefoil protein family[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(24):11017-11021.

2 Seib T,Blin N,Hilgert K,et al.The three human trefoil genes TFF1,TFF2,and TFF3 are located within a region of 55 kb on chromosome 21q22.3[J].Genomics,1997,40(1):200-202.

3 杜廷義,張勇,張云.三葉因子：從實驗室研究到臨床醫學[J].動物學研究,2010,31(1):17-26.

4 Kouznetsova I,Kalinski T,Peitz U,et al.Localization of TFF3 peptide in human esophageal submucosal glands and gastric cardia:differentiation of two types of gastric pit cells along the rostro-caudal axis[J].Cell Tissue Res,2007,328(2):365-374.

5 Taupin D,Pedersen J,Familari M,et al.Augmented intestinal trefoil factor (TFF3)and loss of pS2(TFF1)expression precedes metaplstic differentiation of gastric epithelium[J].Lab Invest,2001,81(3):397-408.

6 Hinz M,Schwegler H,Chwieralski CE,et al.Trefoil factor family(TFF)expression in the mouse brain and pituitary:changes in the developing cerebellum[J].Peptides,2004,25(5):827-832.

7 Vestergaard EM,Nexo E,Wendt A,et al.Trefoil factors in human milk[J].Early Hum Dev,2008,84(10):631-635.

8 Samson MH,Poulsen SS,et al.Trefoil factor family peptides in the human foetus and at birth[J].Eur J Clin Invest,2011,41(7):785-792.

9 Kadri SR,Lao-Sirieix P,O’Donovan M,et al.Acceptability and accuracy of a non-endoscopic screening test for Barrett’s oesophagus in primary care:cohort study[J].BMJ,2010,341:c4372.

10 Yio X,Zhang JY,Babyatsky M,et al.Trefoil factor family-3 is associated with aggressive behavior of colon cancer cells[J].Clin Exp Metastasis,2005,22(2):157-165.

11 Vestergaard EM,Borre M,Poulsen SS,et al.Plasma levels of trefoil factors are increased in patients with advanced prostate cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(3 Pt 1):807-812.

12 Khoury T,Chadha K,Javle M,et al.Expression of intestinal trefoil factor (TFF-3) in hepatocellular carcinoma[J].Int J Gastrointest Cancer,2005,35(3):171-177.

13 Kim YS,Ho SB.Intestinal goblet cells and mucins in health and disease:recent insights and progress[J].Curr Gastroenterol Rep,2010,12(5):319-330.

14 Renes IB,Verburg M,Van Nispen DJ,et al.Epithelial proliferation,cell death, and gene expression in experimental colitis:alterations in carbonic anhydrase I,mucin MUC2,and trefoil factor 3 expression[J].Int J Colorectal Dis,2002,17(5):317-326.

15 王煥,吳修文,萬千雪,等.腸三葉因子和黏蛋白對燒傷血清所致腸上皮細胞增殖移行能力變化的影響[J].中華燒傷雜志,2011,27(5):347-352.

16 吳修文,王煥,萬千雪,等.腸三葉因子和黏蛋白對燒傷血清所致腸上皮細胞免疫功能變化的影響[J].中華燒傷雜志,2011,27(5):341-346.

17 Baus-Loncar M,Kayademir T,Takaishi S,et al.Trefoil factor family 2 deficiency and immune response[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(24):2947-2955.

18 Teng X,Xu LF,Zhou P,et al.Effects of trefoil peptide 3 on expression of TNF-alpha,TLR4,and NF-kappaB in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis mice[J].Inflammation,2009,32(2):120-129.

19 Loos M,De Creus A,Thim L,et al.Murine trefoil factor 3 does not directly modulate LPS-mediated dendritic cell function[J].Scand J Immunol,2007,66(1):35-42.

20 Taupin DR,Kinoshita K,Podolsky DK.Intestinal trefoil factor confers colonic epithelial resistance to apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(2):799-804.

21 Chen YH,Lu Y,De Plaen IG,et al.Transcription factor NF-kappaB signals antianoikic function of trefoil factor 3 on intestinal epithelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,274(3):576-582.

22 Uchino H,Kataoka H,Itoh H,et al.Overexpression of intestinal trefoil factor in human colon carcinoma cells reduces cellular growth in vitro and in vivo[J].Gastroenterology,2000,118(1):60-69.

23 Niessen CM.Tight junctions/adherens junctions:basic structure and function[J].J Invest Dermatol,2007,127(11):2525-2532.

24 Hoffmann W.Trefoil factors TFF (trefoil factor family)peptide-triggered signals promoting mucosal restitution[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(24):2932-2938.

25 Kjellev S.The trefoil factor family-small peptides with multiple functionalities[J].Cell Mol Life Sci,2009,66(8):1350-1369.

26 Sturm A,Dignass AU.Epithelial restitution and wound healing in inflammatory bowel disease[J].World J Gastroenterol,2008,14(3):348-353.

27 Kalabis J,Rosenberg I,Podolsky DK.Vangl1 protein acts as a downstream effector of intestinal trefoil factor(ITF)/TFF3 signaling and regulates wound healing of intestinal epithelium[J].J Biol Chem,2006,281(10):6434-6441.

28 Krishnan K,Arnone B,Buchman A.Intestinal growth factors:potential use in the treatment of inflammatory bowel disease and their role in mucosal healing[J].Inflamm Bowel Dis,2011,17(1):410-422.

29 Taupin D,Wu DC,Jeon WK,et al.The trefoil gene family are coordinately expressed immediate-early genes:EGF receptor-and MAP kinase-dependent interregulation[J].J Clin Invest,1999,103(9):R31-R38.

30 Li J,Zhou R,He WC,et al.Effects of recombinant human intestinal trefoil factor on trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis in rats[J].Mol Biol Rep,2011,38(7):4787-4792.

31 王林.腸三葉肽因子受體的分離、鑒定及其生物學信息分析[D].上海:第三軍醫大學,2009.

32 Podolsky DK,Gerken G,Eyking A,et al.Colitisassociated variant of TLR2 causes impaired mucosal repair because of TFF3 deficiency[J].Gastroenterology,2009,137(1):209-220.