膽汁酸對胃癌細胞株MKN-28生長的影響*

王學偉 曹 勤

上海中醫藥大學附屬普陀醫院消化內科(200062)

膽汁反流入胃甚至食管的現象十分常見[1～3]，可造成胃黏膜腸化生、反流性食管炎、Barrett食管甚至食管腺癌等[4～17]。但膽汁反流致胃部疾病的具體機制仍未闡明。本研究以胃癌細胞株MKN-28為研究對象，體外觀察脂溶性膽汁酸牛磺石膽酸鈉（taurolithocholate,TLC）和水溶性膽汁酸甘氨鵝脫氧膽酸鈉（glycochenodeoxycholate,GCDC）對其生長的影響，旨在明確不同膽汁酸對胃癌細胞生長的直接作用。

材料與方法

一、細胞株、主要試劑與儀器

胃癌細胞株MKN-28購自上海市消化疾病研究所。RPMI-1640培養基、牛血清白蛋白購自Gibco公司；TLC、GCDC、DMSO購自Sigma公司；MTT購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。ELIZA MAT 3000全自動比色儀購自DRG公司。

二、方法

1.細胞培養：將處于對數生長期的MKN-28細胞置于培養箱（36.5℃、含5%CO2）。細胞以1500個/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL含血清的RPMI-1640培養基。24 h后棄培養液，PBS洗滌3次，加入200 μL無血清培養基。TLC 組加入不同濃度 TLC（6 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L和 300 μmol/L）， 連續培養 6 d；GCDC 組加入 300 μmol/L GCDC，培養24 h。對照組加入等體積無血清培養基，培養時間相同。

2.MTT測定：每孔加入20 μL MTT溶液，孵育2 h。棄培養液，加入100 μL DMSO，室溫搖晃5 min。 ELIZA Mat-3000全自動比色儀于570 nm處測定吸光度A值，并于630 nm處測定吸光度A值進行校正，以此反應細胞的生長情況。

三、統計學分析

應用SAS 6.12統計軟件，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

從第 1～6 d，6 μmol/L TLC對 MKN-28細胞的生長無顯 著 影 響 。 干預至第 4 d 起 ，60 μmol/L、100 μmol/L 和300 μmol/L TLC均顯示對MKN-28細胞生長有抑制作用；至第5 d時，抑制作用最顯著。第6 d時，抑制作用稍減弱（見圖 1A～1C，P<0.05）。 進一步比較 100 μmol/L 與 300 μmol/L TCL對MKN-28細胞生長的抑制作用，結果示至干預的第5～6 d，300 μmol/L TCL組MKN-28細胞生長的抑制程度明顯強于 100 μmol/L 組（見圖 1D，P＜0.05）。 以上結果表明，TLC對MKN-28細胞生長的抑制作用與劑量相關。

300 μmol/L GCDC干預24 h，GCDC干預組的吸光度A值明顯高于對照組，差異有統計學意義（0.0469±0.0059對0.0103±0.0014，P＜0.05）。 由此提示 300 μmol/L GCDC 可明顯抑制MKN-28細胞生長。

討 論

以往研究發現，胃大部切除術易致膽汁反流入胃，是引起胃小凹上皮增生的重要原因，亦可能與殘胃癌等的發生有關。近年，隨著膽汁反流監測技術廣泛應用于臨床，研究[1～3]發現即使無上消化道手術史，膽汁反流入胃甚至食管的現象亦十分常見，并可能與胃黏膜腸化生、反流性食管炎、Barrett食管甚至食管腺癌等的發生有關[4～17]。因此，膽汁反流不僅是一種術后并發癥，且生理狀況下的過度反流，亦可能參與某些胃和食管疾病的發生和發展，因此具有潛在致病作用。Dresner等[10]的研究亦支持上述觀點。但目前膽汁反流致胃部疾病的具體機制尚未完全闡明，本研究觀察脂溶性TLC和水溶性GCDC對體外培養的胃癌細胞株MKN-28生長的影響，旨在明確膽汁反流致胃部疾病的可能機制。

脂溶性膽汁酸TLC和水溶性膽汁酸GCDC是膽汁酸家族的兩大重要成分。其中TLC的水溶性較差，在無血清RPMI-1640培養基中的濃度＞25 μmol/L即會析出，為保持其水溶性，本研究以牛血清白蛋白按4∶1的摩爾比配置TLC溶液，按照預實驗結果將TLC濃度設置為6 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L 和 300 μmol/L。 GCDC 的水溶性較好，可直接溶于RPMI-1640無血清培養基。本課題組的預實驗發現，100 μmol/L 和 200 μmol/L GCDC 對 MKN-28 細胞生長的影響均不顯著，遂將GCDC劑量增至300 μmol/L，結果示干預24 h即可明顯抑制MKN-28細胞生長。

MTT比色法檢測細胞死亡率的原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶并沉積于細胞內，DMSO可溶解此結晶，通過酶聯免疫檢測儀測定吸光度A值，可間接反映活細胞的數量。因此本研究采用MTT比色法檢測細胞死亡，結果示60 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L TLC干預至第4 d起，可明顯抑制MKN-28細胞生長。至第5 d時，抑制作用最顯著；第6 d時，抑制作用稍減弱；300 μmol/L TCL干預第5～6 d時，對MKN-28細胞生長的抑制作用明顯強于100 μmol/L。GCDC 300 μmol/L干預24 h亦可顯著抑制MKN-28細胞生長。由此提示無論是脂溶性還是水溶性膽汁酸，均可在體外直接抑制胃癌細胞生長。

近年研究發現，膽汁酸可誘導肝細胞凋亡。GCDC誘導肝細胞凋亡的過程中，Fas（CD95）可發生不依賴配體的寡聚化激活，通過結合Fas相關死亡功能體激活凋亡蛋白酶8，激活一系列下游凋亡蛋白酶，包括組織蛋白酶B，使其從胞質轉移至胞核并發揮蛋白水解酶活性，從而參與細胞的凋亡[18,19]。推測本研究中GCDC抑制胃癌細胞生長與其通過CD95途徑誘導胃癌細胞的凋亡有關，但還需進一步研究證實。

牛磺石膽酸-3-硫酸（TLCS）是TLC的脂溶性硫酸化產物[20]，可誘導肝細胞凋亡，其機制可能與活性氧產物激活Src激酶家族成員Yes，后者進一步激活JNK和PKC并活化CD95，由此誘導細胞凋亡有關[20～22]。上述研究提示TLC可能通過Yes-JNK/PKC-CD95途徑促進胃癌細胞凋亡。

體內研究[10]提示長期膽汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鱗狀上皮增生，并可能與腸化生甚至癌變有關。與此處TLC和GCDC抑制胃癌細胞生長，促進胃癌細胞凋亡的作用不符，由此提示長期膽汁反流可能存在間接作用機制，通過克服膽汁酸對胃上皮細胞生長的直接抑制作用而促進其增生，但目前其中的機制尚不明確，還需進一步研究證實。

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