靶向清除膠質(zhì)瘤干細胞在膠質(zhì)母細胞瘤治療方面的應(yīng)用前景☆

于圣平 張瑩 楊學軍

膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastomas，GBMs；WHOⅣ級）是最致命的人類腫瘤之一，因其富集血管和彌漫浸潤性生長，使得手術(shù)不能全切除，易在切除的腫瘤殘腔周圍復發(fā)。膠質(zhì)母細胞瘤高度不均一性，分為三個等級，最高級的是腫瘤干細胞，位于塔頂，接下來是分化階段的腫瘤祖細胞，位于塔底的是已分化的大量腫瘤細胞。現(xiàn)在的治療往往針對的是腫瘤實體中的分化細胞，而忽視了前兩種細胞，雖然這些干細胞只占膠質(zhì)母細胞瘤的很小一部分，但很可能負責腫瘤的起源和生長，侵襲和復發(fā)及遠處播散。膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）具有下列特性：自我更新、無限增殖、多向分化潛能、表達神經(jīng)干細胞的標志物、培養(yǎng)于干細胞培養(yǎng)基中能形成細胞球、接種于免疫缺陷小鼠顱內(nèi)能獨立成瘤［1］。GSCs的起源至今未明，可能來源于遺傳或表觀遺傳突變的神經(jīng)干細胞或祖細胞，或者星形膠質(zhì)細胞經(jīng)過一系列的突變或重新編程而來。GSCs比一般細胞對放射治療和化學治療更加耐受［2］。GSCs的這些特性被視為是膠質(zhì)母細胞瘤惡性表型和術(shù)后復發(fā)的根源，GSCs是膠質(zhì)母細胞瘤的“種子細胞”，針對GSCs的研究或治療更能模擬膠質(zhì)母細胞瘤的真實情況，可見GSCs已成為研究治療腦膠質(zhì)母細胞瘤的新工具。針對膠質(zhì)瘤干細胞的治療為根治膠質(zhì)母細胞瘤帶來希望，策略包括增加對放療和化療的敏感性、破壞微環(huán)境、誘導分化、干擾細胞特有的表面分子或信號通路、免疫及基因治療等，本文就這些策略的研究進展作一概述。

1 針對膠質(zhì)瘤干細胞的傳統(tǒng)治療

傳統(tǒng)的抗腫瘤治療主要作用于腫瘤的實體，其療效有限，原因是腫瘤本質(zhì)上具有抵抗化學療法和放射治療的能力或在治療過程中獲得此種能力。而執(zhí)行這一能力的可能是腦腫瘤干細胞，其中的機制包括自噬作用、環(huán)氧化酶－2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）依賴的炎癥反應(yīng)、抑制凋亡、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-Binding cassette，ABC）的外排功能、Notch 信號通路介導作用、DNA損傷修復反應(yīng)［2］。那么針對GSCs的治療方案會使腫瘤對放射和化學治療變得敏感，進而使現(xiàn)有的治療更加有效；①逆轉(zhuǎn)腫瘤放療抵抗的策略：Bao等［3］發(fā)現(xiàn)GSCs通過優(yōu)先活化DNA損傷修復反應(yīng)和增強DNA修復能力耐受放療，放療能增加培養(yǎng)基或移植瘤中干細胞的比例；細胞周期檢測點激酶 1 和 2（checkpoint kinase 1 and 2，CHK1 and CHK2）是生物進化過程中非常保守的蛋白激酶，是DNA損傷修復反應(yīng)中優(yōu)先活化的蛋白，其小分子抑制劑Debromohymenialdisine（DBH）能解除GSCs的放療抵抗。使用γ-secretase抑制物或短發(fā)卡 RNA（a small hairpin RNA，shRNA）抑制 Notch通路能使GSCs 對放療變得敏感［4］。CD133（＋）GSCs 相比于 CD133（－）的腫瘤細胞表達較高水平的sirtuin1（SIRT1），特異性的SIRT1抑制物可以顯著地增加CD133（＋）GSCs對放療的敏感性，可見 SIRT1是逆轉(zhuǎn)GSCs放療抵抗的一個潛在目標［5］。一旦GSCs變得對放療敏感，放療就能更好的殺傷GSCs，那么膠質(zhì)母細胞瘤就會因缺少種子細胞而不能繼續(xù)分裂增殖最終停止生長；②逆轉(zhuǎn)腫瘤化療抵抗的策略：GSCs高表達ABC亞家族中的ABCG2，ABCG2在膠質(zhì)母細胞瘤化療抵抗中起關(guān)鍵作用，microRNA-328能作用于ABCG2基因，下調(diào)ABCG2的表達，消弱GSCs的化療抵抗［6］。Tie2受體的激活導致人類膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)BC轉(zhuǎn)運體的表達增高，使用特異性的小干擾RNA沉默Tie2能消除化學抵抗，證實了Tie2受體在膠質(zhì)瘤化學抵抗中的 作 用［7］。

2 抗GSCs的血管微環(huán)境治療

血管形成是膠質(zhì)母細胞瘤生長和發(fā)展的重要條件，腫瘤的體積超過幾個立方毫米時就需要新生血管提供營養(yǎng)才能繼續(xù)生長［8］。血管密度與腫瘤的惡性程度和臨床預后緊密相關(guān)。基于相應(yīng)的研究［9－10］，發(fā)現(xiàn) GSCs 位于血管旁的 niche，與內(nèi)皮細胞構(gòu)成相互作用的共同體，GSCs能增強血管形成來促進腫瘤發(fā)展，同時內(nèi)皮細胞能維持干細胞的特性。Folkins等［11］利用C6大鼠膠質(zhì)瘤細胞系中的貼壁細胞和C6細胞形成的干細胞球與內(nèi)皮細胞的相互作用，發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤干細胞通過分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)細胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor-1，SDF1）動員局部的內(nèi)皮細胞和招募骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞促進血管的形成，腦腫瘤干細胞形成的腫瘤比腫瘤細胞形成的腫瘤更富有微血管。Rong等［12］發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細胞瘤CD133陽性的細胞中含有一部分表達血管內(nèi)皮－鈣黏蛋白的細胞 ［vascular endothelial-cadherin （CD144）-expressing cells，CD144 細胞］，具有內(nèi)皮祖細胞的特點，能分化成熟為內(nèi)皮細胞，即GSCs直接分化為內(nèi)皮細胞參與血管的形成。而內(nèi)皮細胞對干細胞的影響也很明顯，niche中的內(nèi)皮細胞維持GSCs的特性和生存，GSCs和內(nèi)皮細胞共移植，可以顯著加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展及促進GSCs的擴增［10］。移植了膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）的小鼠接受貝伐單抗（bevacizumab）抗血管藥物的治療，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長減慢，GSCs大量消失［10］。抗血管藥物容易導致腫瘤缺氧，腫瘤中心缺氧的壞境促進了缺氧誘導因子 （hypoxia-inducible factors，HIFs）的產(chǎn)生，從而刺激GBM產(chǎn)生大量的VEGF，進而促進微血管的形成。GSCs和腫瘤細胞對缺氧的反應(yīng)是不一樣的，HIF1a產(chǎn)生于所有的腫瘤細胞，而HIF2a只產(chǎn)生于GSCs，正常的神經(jīng)祖細胞不表達；更重要的是HIF2a的表達和膠質(zhì)瘤患者的預后差相一致［13］。提示HIF2a可作為GSCs的特異性作用靶點，下調(diào)或抑制HIF2a的表達在減少GSCs數(shù)量的同時又能抑制腫瘤血管的形成。Folkins等［14］發(fā)現(xiàn)抗血管藥物聯(lián)合細胞毒藥物可以減少移植瘤中腦腫瘤干細胞的數(shù)量。傳統(tǒng)的化學治療能殺傷血管中的內(nèi)皮細胞，但化療間期，血管里的內(nèi)皮細胞又得到了恢復，而采用節(jié)律化療有效地解決了這一問題，小劑量持續(xù)給藥，即抑制了腫瘤內(nèi)皮細胞的分裂和生存，又阻止了內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的招募［15］。 針對血管或內(nèi)皮細胞的治療，均能干擾腫瘤干細胞微環(huán)境的功能，在抑制腫瘤生長的同時還消弱了腫瘤的根本，即niche中的腫瘤干細胞；針對GSCs的治療在殺傷干細胞的同時也能減少腫瘤血管的形成。

3 誘導分化治療

GSCs和神經(jīng)干細胞具有某些相似的特性，其中之一就是多向分化潛能。膠質(zhì)母細胞瘤或移植瘤來源的GSCs擁有分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元的能力。這些已分化的細胞就喪失了體外擴增細胞和體內(nèi)繁殖腫瘤的能力，同時對傳統(tǒng)的抗腫瘤治療變得敏感，提示誘導干細胞分化的治療不失為一種不錯的策略。誘導靜止的腫瘤干細胞分化為更成熟的腫瘤細胞的方法包括：激活不同的信號通路、表觀遺傳學分化治療、使用micro-RNAs改變基因表達譜等。

一些參與誘導腫瘤干細胞分化的信號通路已經(jīng)被確認，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogen proteins，BMPs）是細胞活素類家族的成員，可以抑制GSCs分裂并能促進其分化為星形及神經(jīng)類細胞，體內(nèi)針對GCSc的BMP4可以顯著抑制膠質(zhì)母細胞瘤的生長和減少腫瘤侵襲［16］。BMPs能促進GSCs向膠質(zhì)細胞分化，但同時也發(fā)現(xiàn)來源于某個膠質(zhì)母細胞瘤的GSC對于BMP的反應(yīng)顯示出增強的細胞分裂而不是分化，這是因為此份標本的GSCs由于表觀遺傳沉默而不表達骨形態(tài)蛋白受體 1B（bone morphogen protein receptor 1 B，BMPR1B）［17］。利用干擾RNA篩選方法，沉默轉(zhuǎn)化／轉(zhuǎn)錄域相關(guān)蛋白（transformation／transcription domain-associated protein，TRRAP）被發(fā)現(xiàn)能增加GSCs的分化，敲低TRRAP表達使GSCs對凋亡刺激物敏感，抑制細胞周期進程，阻礙體內(nèi)腫瘤形成，顯示出TRRAP能保持GSCs的干細胞性質(zhì)和致瘤性［18］。微小RNA（microRNA）被證實在膠質(zhì)瘤細胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用：相比于正常腦組織和非干細胞性細胞，miR-451在GSCs中表達是減少的，其過表達能抑制干細胞的分裂并誘導其分化，外源性表達miR-451能干擾膠質(zhì)瘤干細胞球的形成和阻礙其形成的腫瘤的生長［19］。高級別膠質(zhì)瘤中miR-124和miR-127的表達是偏低的，其過表達也能抑制GSCs的增殖，促進GSCs 的 分 化［20］。

4 針對特殊的細胞表面分子的治療

表達于GSCs的表面分子可能是治療膠質(zhì)母細胞瘤理想的目標，這幾個分子是：CD133（prominin-1）、CD15、L1CAM、A2B5。盡管CD133已經(jīng)被廣泛的用作GSCs的標志物，但是正常的神經(jīng)干細胞也表達CD133，限制其應(yīng)用。這些分子中，以神經(jīng)細胞黏附分子L1CAM的應(yīng)用前景最好，它表達于GSCs，對GSCs的保持、生存和功能起關(guān)鍵作用。L1CAM介導細胞外和細胞內(nèi)信號傳導，調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移、生存、生長和腫瘤細胞侵襲。相比于膠質(zhì)母細胞瘤的腫瘤細胞和正常的神經(jīng)祖細胞，L1CAM在GSCs中高表達。使用特異性的shRNA敲低L1CAM能干擾體外的干細胞形成細胞球和GSCs生長，針對膠質(zhì)瘤干細胞中的L1CAM的治療可以顯著抑制顱內(nèi)荷GBM移植瘤鼠的腫瘤生長和延長荷瘤鼠的壽命［21］。

5 干擾信號通路的治療

盡管針對腫瘤干細胞的治療激發(fā)了很大的興趣，但關(guān)于腫瘤干細胞的分子信號通路研究才剛剛開始，腫瘤干細胞即享有實體干細胞或祖細胞的某些特性，又在基因和分子信號水平不同于正常的干細胞。尋找GSCs特有的信號通路，利用特異性抗體、小分子抑制劑或分子生物學方法干擾信號通路中的關(guān)鍵分子，從而降低干細胞的增值，阻遏惡性轉(zhuǎn)化。

Notch調(diào)節(jié)正常神經(jīng)干細胞的自我更新和分化，GSCs比非干性的細胞擁有更高的Notch活性。γ-secretase抑制劑（GCIs）能阻斷Notch通路，阻礙干細胞球的生長和克隆形成，治療裸鼠皮下的膠質(zhì)瘤，能抑制腫瘤生長，延長動物生存期，其機制是消弱AKT和STAT3磷酸化作用來減少腫瘤干細胞分裂和增加其凋亡［22］。磷酸磷脂酰肌醇-3羥基激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路是另一個候選目標，小分子Akt抑制劑能有效地減少GSCs的數(shù)量，抑制侵襲和遷移，并在體內(nèi)抑制腫瘤生長［23］。Hedgehog通路在GSCs中也發(fā)現(xiàn)被激活，Hedgehog抑制劑環(huán)杷明消除了GSCs的體外克隆性生長和抑制了體內(nèi)的腫瘤產(chǎn)生［24］。A20是 NF-κB通路的調(diào)解物，在GSCs中過表達，攜帶shRNA的腺病毒轉(zhuǎn)染GSCs能敲低A20，進而減弱GSCs的自我更新，生長和易于凋亡［25］。GSCs高表達c-Myc基因，shRNA減弱c-Myc的表達，相比于非干細胞GSCs表現(xiàn)出增值減緩、凋亡增加、細胞周期停滯，體外形成細胞球和體內(nèi)成瘤能力均消失［26］。最近發(fā)現(xiàn)，趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）高表達于膠質(zhì)瘤干細胞系，在傳統(tǒng)血清培養(yǎng)的細胞系中低表達。AMD3100是CXCR4的拮抗劑，能抑制體外細胞的遷移和減弱體內(nèi)高侵襲性的膠質(zhì)瘤干細胞系移植瘤的生長［27］。

6 免疫治療

大腦被認為是一個免疫豁免的區(qū)域，對腫瘤的免疫反應(yīng)受選擇性血腦屏障的影響，只有活化的T細胞能到達顱內(nèi)。最近的一些研究顯示GSCs能通過相關(guān)腫瘤抗原的缺少逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視及免疫治療的殺傷，具有免疫抑制作用。Wei等［28］觀察到GSCs能顯著的抑制T細胞分裂和活化作用，誘導調(diào)節(jié)細胞（regulatory T-cell）產(chǎn)生和觸發(fā)T細胞凋亡。所以GSCs可能促使腫瘤逃避免疫監(jiān)視，消除GSCs或誘導GSCs分化能增強對腫瘤的免疫反應(yīng)。白細胞介素6（interleukin 6，IL6）信號可能刺激GSCs的生長和生存，其受體alpha（interleukin 6 receptor alpha，IL6Ralpha）和糖蛋白 130（glycoprotein130，gp130）優(yōu)先表達于GSCs，阻斷其受體或干擾IL6的表達能抑制GSCs的增殖達到阻礙腫瘤的生長及延長荷GSCs來源的膠質(zhì)瘤鼠的生存期及明顯消弱了GSCs的增殖能力。臨床上，IL6的配體和受體增加的患者往往生存期減少，顯示出針對IL6信號的治療有潛在的臨床應(yīng)用價值［29］。通過穿孔素介導的機制，溶細胞的 T淋巴細胞（cytolytic T lymphocytes，CTL）能殺死 GSCs，Brown等A－［30］證實，一組來源于高級別膠質(zhì)瘤的剛傳代的GSCs，能被CD8（＋）CTL識別并清除，為用免疫方法清除這類細胞打下了基礎(chǔ)。

7 病毒介導的基因治療

在現(xiàn)代抗腫瘤治療領(lǐng)域的基因療法和病毒治療兩個方面，病毒顯示了可喜的效果，以病毒為載體的基因治療GSCs，即利用條件依賴性復制的帶有某種目的基因的病毒，靶向作用于自我更新的GSCs，達到殺傷GSCs的要求。病毒治療的溶瘤作用是通過腫瘤細胞內(nèi)病毒的復制導致腫瘤細胞的溶解來實現(xiàn)的，為達到有效的溶瘤活性，載體必須滿足：對腫瘤的高選擇性，輕微的腦部或全身的毒副作用，穿過腦組織滲透到腫瘤殘腔外的腫瘤灶，在激起免疫反應(yīng)的情況下仍保持病毒活性。目前，載體介導的基因治療在醫(yī)治人膠質(zhì)瘤方面收獲甚微，主要的阻礙因素是腫瘤選擇性差、轉(zhuǎn)染效率低、由于病毒基因隨機插入激活癌基因引起的醫(yī)源性腫瘤的風險［2］。解決上面問題的一個新的方法是設(shè)計載體不僅針對腫瘤細胞而且特異性作用于占很小組成部分的GSCs。

溶瘤腺病毒Delta-24-RGD作用于膠質(zhì)母細胞瘤來源的腫瘤干細胞，能引起細胞的自噬性死亡，荷腦腫瘤干細胞來源的膠質(zhì)瘤鼠在接受Delta-24-RGD治療后，平均能活到66.3d，而對照組是 38.5 d［31］。 溶瘤皰疹病毒 oHSV G47delta strain 感染GSCs形成的神經(jīng)球，引起溶瘤細胞死亡，殘存的GSCs的下一代細胞不能再形成干細胞球，瘤內(nèi)注入G47delta，能明顯的改善荷 GSC 來源的原位腫瘤鼠的生存［32］。 DCX（doublecortin）是腦特異的基因，主要表達于神經(jīng)干／祖細胞和新生的神經(jīng)元但在其它腦細胞如膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞中缺失；U87膠質(zhì)瘤細胞系中DCX的表達引起惡性型的喪失：停止分裂，失去遷移能力，不能引導免疫缺陷動物顱內(nèi)腫瘤的發(fā)展，U87來源的原位腫瘤中直接注入表達DCX的慢病毒，腫瘤的體積減少了60%，動物的總體生存期顯著的提高［33］。在一些腫瘤細胞，胚胎干細胞基因 SirT1表達于 CD133（＋）GSCs，表達 shRNA 的慢病毒載體能敲低 CD133（＋）GSCs的 SirT1表達，沉默 SirT1，使CD133（＋）細胞變得對電離輻射（ionizing radiation，IR）敏感，增強了 IR 誘 導 的 凋亡［5］。

8 問題和展望

人腦膠質(zhì)瘤干細胞和神經(jīng)干細胞有非常相似的特性，針對腦膠質(zhì)瘤干細胞的治療怎樣才能在清除腫瘤干細胞的同時而不損傷或少損傷正常的神經(jīng)干細胞，或者在殺傷腫瘤干細胞的同時給予預防認知紊亂的藥物，糾正由于正常神經(jīng)干細胞受到誤傷引起的功能障礙。這需要深入研究兩者之間的區(qū)別，使治療更具有針對性和特異性。Wang 等［34］證明 CD133（－）的腫瘤細胞在裸大鼠上也能形成腫瘤，并在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了CD133（＋）的細胞，體內(nèi)傳代幾次后惡性程度增加，血管形成明顯。可見鑒定GSCs的專有標志物目前還沒發(fā)現(xiàn)，需要努力尋找腦腫瘤干細胞特有的分子標志，進而用于靶向治療，也顯示出只針對腫瘤干細胞或者分化的腫瘤細胞的治療是不充分的，殘存的細胞可能分化為其他基因型的細胞，需要聯(lián)合幾種方案全面的消除腫瘤細胞。GSCs是不是像腫瘤細胞一樣也具有高度不均一性？腫瘤生長和維持的干細胞、抵抗性的干細胞、侵襲或遷移的干細胞、促進血管形成的干細胞等是同一種干細胞還是不同亞類的干細胞，針對GSCs的治療能全殲這些細胞嗎？不同的患者腫瘤干細胞的數(shù)量和突變的基因是不同的，這就需要在全面了解腫瘤的分子生物學和分子遺傳學的基礎(chǔ)上，采取個性化的綜合治療［35］。基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用還是存在明顯的差異，實驗中取得的好的治療效果，可能應(yīng)用于臨床起效并不是很大。針對GSCs的治療道路是曲折的，也剛剛起步，卻提供了一種新穎的可能徹底治愈膠質(zhì)瘤的辦法。

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