HPLC法測(cè)定小花清風(fēng)藤膠囊中齊墩果酸的含量

楊 瑩 張永萍 梁光義

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

小花清風(fēng)藤膠囊是由小花清風(fēng)藤等3味中藥制成的中藥復(fù)方制劑。其中小花清風(fēng)藤為方中君藥，是貴州苗族地區(qū)民間常用的苗藥，具有清熱利濕，利膽，止血的功效，常用于治療急性黃疸性肝炎［1］。齊墩果酸作為小花清風(fēng)藤藥材中的有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明其具有護(hù)肝解肝毒而治療急慢性肝炎的作用［2］。因此，本文選擇齊墩果酸作為定量指標(biāo)成分，采用HPLC法測(cè)定小花清風(fēng)藤膠囊中齊墩果酸的含量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(日本島津/LC－20AT)，超聲波清洗器(天津恒奧/HS10260D)，電子天平(上海奧豪斯/AR2130)，齊墩果酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110709－2000304)，小花清風(fēng)藤膠囊(由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院制劑實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20120216，20120219，20120222)，甲醇(色譜純)，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18柱(250 ×4.6mm，5μm);流動(dòng)相：甲醇 －水 －冰醋酸 －三乙胺(87：13：0.04：0.02);檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm;柱溫：30℃;流速：1mL/min。進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取齊墩果酸對(duì)照品適量于25ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成濃度為0.0731mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備：取膠囊內(nèi)容物細(xì)粉0.36g，精密稱定，加入70%乙醇50mL，超聲處理30min，搖勻，再加入15%鹽酸50mL，水浴回流4小時(shí)，取出，放冷，再加入等體積氯仿萃取，共萃取3次，合并氯仿層，濃縮蒸干，加入30mL甲醇溶解，精密吸取10mL至蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?mL甲醇溶解，過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照液的制備：取不含小花清風(fēng)藤的處方藥材，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.5 空白干擾實(shí)驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液以及陰性對(duì)照液各20?L，分別注入高效液相色譜儀，同法測(cè)定，結(jié)果在齊墩果酸峰相對(duì)應(yīng)的位置上，陰性對(duì)照品無(wú)干擾，見圖。

圖1 空白干擾實(shí)驗(yàn)

2.6 線性關(guān)系考察：精密稱取齊墩果酸對(duì)照品9.43mg于25ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成濃度為 0.3772mg/ml的齊墩果酸對(duì)照品溶液。再?gòu)闹懈魅?mL分別定容至 2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL，配成 0.1886mg/mL、0.1257mg/mL、0.0943mg/mL、0.0754mg/mL、0.0627mg/mL、0.0539mg/mL 的對(duì)照品溶液，分別取 20μL 進(jìn)樣。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，的回歸方程A=107C－103149，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，表明齊墩果酸在 0.0539 ～0.1886mg/ml范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。

表1 齊墩果酸線性范圍考察(n=6)

圖2 齊墩果酸線性范圍考察

2.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液(濃度為0.0539mg/mL)20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定齊墩果酸峰面積的平均積分值為592982.3，其RSD=2.3%，表明其精密度良好。

表2 精密度考察(n=6)

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)：取同批樣品6份，批號(hào)為20120219，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，并測(cè)定小花清風(fēng)藤膠囊中齊墩果酸的平均含量為2.83mg/g，其RSD=1.9%。

表3 重復(fù)性考察(n=6)

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液20μL，按上述色譜條件每隔2小時(shí)進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果表明樣品溶液在10h內(nèi)基本穩(wěn)定，其RSD=2.4%。

表4 穩(wěn)定性考察(n=6)

2.10 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的同一批號(hào)膠囊內(nèi)容物共9份，分別加入相當(dāng)于80%、100%、120%的對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，按上訴色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)(n=9)

2.11 樣品含量測(cè)定：取3批樣品各2份，按供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果3批樣品的平均含量分別為2.91mg/g、2.87mg/g、2.76mg/g。結(jié)果見表 6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

本文曾參考文獻(xiàn)資料［3］提取制劑中的齊墩果酸，但是其含量較低，提取也不完全。綜合制劑的制備工藝提取方法，確定了供試品溶液采取先超聲后回流水解的步驟，另外，筆者還單因素考察了超聲提取溶劑的用量，提取時(shí)間，萃取溶劑的用量等，最終確定了70%乙醇的用量為50mL、超聲時(shí)間為30min、萃取溶劑的量與提取溶液等體積時(shí)，提取更完全，齊墩果酸含量更高。

采用高效液相色譜法測(cè)定小花清風(fēng)藤膠囊中齊墩果酸的含量，方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好，且制劑中的其他成分對(duì)測(cè)定不形成干擾，可用于小花清風(fēng)藤膠囊的質(zhì)量控制。

［1］徐樹蕓.貴州十種民族藥的應(yīng)用研究［J］.世界科學(xué)技術(shù) － 中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8(6)：73 －78.

［2］張蜀艷，李政.齊墩果酸研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46(4)：20 －24.

［3］羅小軍.HPLC法測(cè)定天胡荽愈肝膠囊中齊墩果酸的含量［J］.中國(guó)藥事，2006，20(11)：696－697.