苗藥雙腎草多糖免疫調節作用研究

劉育辰 劉 剛 邱德文 王振宇 邱明華

(1.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002; 2.昆明醫學院，云南 昆明 650031;3.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室;云南 昆明 650204)

苗藥雙腎草為蘭科植物條葉角盤蘭(Herminium bulleyi(Rolfe)Tang et Wang)的塊莖，因兩枚塊莖形似雙腎，故而得名，是貴州苗族人民的習用藥材之一。別名竹蘭草，小棕鄉(湖南藍山)，奔豬覓(藍山瑤族語)。生于海拔2500 ～3300 m 的山坡林下或草地上［1，2］，分布于湖南、四川西南部、貴州、云南西北部、西藏東部等地［3］，錫金、印度東北部、緬甸、越南、老撾、柬埔寨、馬來西亞、日本亦有分布［4］。本品甘、溫，入腎經。具有溫補腎陽的功效。用于腎虛陽痿遺泄，腎陽不足，精關不固，常致陽痿、遺精、滑泄，血不養筋，精不生髓，則腰膝酸軟等癥［5］。民間常將其用水煎服或泡酒服。

腎為先天之本，腎中精氣不僅能促進人的生長發育，而且具有保衛機體，提高機體免疫、防止邪侵的作用。雙腎草多糖是雙腎草中的重要成分，而有關雙腎草多糖是否具有提高機體免疫的作用尚未見相關報道。本研究從雙腎草中提取多糖，并研究了雙腎草多糖對小鼠的免疫調節作用，為進一步研究開發苗藥雙腎草的藥用價值奠定基礎。

1 儀器與試劑

材料：雙腎草，購于貴陽萬東橋藥材市場，經貴陽中醫學院生藥教研室劉芃教授鑒定為蘭科植物條葉角盤蘭(Herminium bulleyi(Rolfe)Tang et Wang)的塊莖，生藥材憑證標本保存在中國科學院昆明植物研究所。

試劑：無水乙醇、丙酮、乙醚市售，均為分析純;生理鹽水(昆明市宇斯藥業有限責任公司)。

儀器：UV－2000紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);AUW120D型電子天平;可調微量加樣槍(上海大龍醫療設備有限公司);恒溫水溫箱(北京光明醫療儀器廠，HH.W21.420型);電子分析天平(Sartorius Group，ALC－210.3型);離心機(上海醫用分析儀器廠，LXY－Ⅱ型)。

實驗動物：健康未交配SPF級ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2g，由昆明醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK(滇)2005－0008。

2 方法與結果

2.1 雙腎草多糖樣品的制備。雙腎草粉碎成粗粉3 Kg，以95%工業甲醇在70℃下加熱回流提取4次，過濾，合并濾液，減壓回收甲醇得浸膏，浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次以除去色素以及有機試劑溶物。在水溶液中加入95%乙醇調至含醇量為80%，放入冰箱靜置過夜，抽濾，干燥，即得粗多糖。將雙腎草粗多糖以水復溶，與等體積Sevage試劑(氯仿－正丁醇3∶1)混合，振搖，反復處理多次除去蛋白，取上清液濃縮至適當體積，加入95%乙醇調至含醇量為80%，放入冰箱靜置過夜，抽濾，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，冷凍干燥，得雙腎草多糖［5－6］。

2.2 雙腎草多糖對小鼠免疫調節作用研究。采用影響體液免疫功能的實驗。將ICR小鼠30只，體重20±2g，雌雄各半，隨機分成3組，每組10只，分為空白對照組和受試物低、高劑量組。空白對照組給予生理鹽水;低劑量組按50 mg·Kg［－1］體重(用生理鹽水配制);高劑量組按 150 mg·Kg［－1］體重(用生理鹽水配制);各組均按 0.2 mL·mg［－1］體重等容量尾靜脈注射給藥，給藥7天后分別進行以下試驗：

2.2.1 雞紅細胞作免疫原的溶血素測定法

2.2.1.1 雞紅細胞混懸液的制備：將采集的新鮮雞血放入裝有玻珠的燒瓶中，振搖10 min，去除纖維蛋白原后，向不凝血中加入生理鹽水清洗紅細胞，以1500轉·min－1離心8min，去上清，反復3次，至上清液透亮為止。將清洗的紅細胞加入生理鹽水配制成5%的混懸液。

2.2.1.2 小鼠免疫：小鼠適應性飼養3天后，連續尾靜脈注射給予受試物7天，于給藥第4天每只小鼠腹腔注射5%生理鹽水雞紅細胞混懸液0.2 mL進行免疫，免疫4天后，摘眼球取血，離心，取血清用生理鹽水稀釋100倍。

2.2.1.3 補體的制備：取豚鼠血，以 3000 轉·min［－1］離心10 min，取血清，用生理鹽水稀釋為10%補體血清。

2.2.1.4 溶血反應：取稀釋的小鼠血清1 mL、10%補體血清1 mL、5%雞紅細胞0.5 mL混勻。置于37℃恒溫水浴中反應30 min后，0℃冰浴終止反應。

2.2.1.5 比色：將反應液以 3000 轉·min［－1］，離心 10 min，取上清液1 mL，于540 nm波長處比色測OD值。另設不加血清的空白對照，取其上清液作為比色時調“0”的基準。以光密度(OD)值讀數作為判定血清溶血素的指標，比較各組差異。

2.2.2 體重、免疫器官重量及臟器指數：將上述各組動物給藥7天后處死，稱量體重并分別取脾臟和胸腺稱重并計算其臟器指數，觀察雙腎草多糖對免疫器官的影響。

2.3 統計學分析：應用SPSS 11.0統計學軟件進行統計分析，采用方差分析和秩和檢驗對試驗數據進行統計學處理，檢驗標準以P＜(0.05)為有顯著性差異。

2.4 試驗結果

2.4.1 溶血素測定試驗結果：通過對小鼠血清溶血素的測定中雖然各組間比較無明顯差異(P＞0.05)，但從其數值上看，有明顯的升高趨勢，有一定的劑量反應關系。(見表1)

表1 雙腎草多糖對小鼠溶血素生成的影響(M，QL～QU)

2.4.2 體重、免疫器官重量及臟器指數測定試驗結果

通過對給藥期間小鼠體重比較，無顯著性差異(P＞0.05)，但給藥末期，動物體重有明顯增重趨勢，高劑量組高于對照組和低劑量組。

雙腎草多糖對胸腺增重不明顯，胸腺指數無明顯增加(P＞0.05);脾臟重量與其指數明顯增加，有明顯的劑量反應關系，高劑量組明顯高于對照組和低劑量組(P＜0.05/0.01)。(見表2～3)

表2 雙腎草多糖對小鼠體重的影響(±SD)

表2 雙腎草多糖對小鼠體重的影響(±SD)

統計學分析：各組間比較無顯著性差異(P＞0.05)

對照組 生理鹽水150 17.91 ±0.99 20.71 ±1.11 23.50 ±2.09 18.02 ±0.99 20.04 ±1.83 21.63 ±2.84低劑量組 50 18.17 ±1.19 20.13 ±1.35 21.82 ±1.29高劑量組

表3 雙腎草多糖對小鼠免疫器官重量及臟器指數的影響(±SD)

表3 雙腎草多糖對小鼠免疫器官重量及臟器指數的影響(±SD)

統計學分析：＊＊與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);△/△△與低劑量組比較有顯著性差異(P＜0.05/0.01)。

0.79 ±0.13 0.37 ±0.07 0.13 ±0.04 0.60 ±0.16低劑量組 50 0.08 ±0.01 0.36 ±0.04 0.14 ±0.03 0.66 ±0.12高劑量組 150 0.08 ±0.01 0.36 ±0.06 0.19 ±0.04＊＊/△△ 0.81 ±0.15＊＊/△對照組 生理鹽水

3 討論

機體免疫功能低下可由多種因素引起。艾滋病和腫瘤化學治療引起的機體免疫功能低下是造成患者受到病原微生物感染并最終治療失敗和死亡的重要原因［6］。目前，對免疫低下患者的治療主要采用一些細胞因子，如干擾素、轉移因子、IL－2以及胸腺素等，這些治療藥物因價格昂貴或不良反應大而難以在臨床廣泛使用。已發現多種植物來源的多糖具有提升免疫功能的作用，如靈芝多糖、大棗多糖等［7－8］。

雙腎草多糖是苗藥雙腎草的多糖成分，但其是否具有增強機體免疫功能的作用目前尚未見報道。本實驗采用溶血素測定法，通過將正常小鼠受雞紅細胞免疫后，即可產生抗雞紅細胞抗體(溶血素)，這種抗體在體外與雞紅細胞、補體一起溫育，即可使雞紅細胞溶解，釋出血紅蛋白，使溶液呈紅色。顏色的深淺，反映了紅細胞溶出量的多少，而紅細胞溶血與血清中抗體含量有關。因此，測定其上清液的光密度，則可間接判斷血清中抗體形成的數量，光密度越大，則說明抗體產生越多，反之亦然。本試驗結果顯示雖然各組間比較無顯著性差異(P＞0.05)，但從其數值上分析，有顯著的升高趨勢，說明存在一定的劑量反應關系，隨著給藥劑量的增加，測定的光密度值也隨之增加，特別是高劑量組與對照組比較有明顯的增加。提示雙腎草多糖可促進正常小鼠體液免疫功能，使抗體生成增加。

體重變化是動物健康及試驗效果的一個初級指標，也是一個很重要的指標，本研究結果顯示在給藥末期小鼠體重明顯增重，且高劑量組高于對照組和低劑量組。雙腎草多糖對小鼠脾臟重量及其指數有明顯增加，且高劑量組與對照組和低劑量組比較有顯著性差異(P＜0.01);對胸腺重量及指數增重不明顯，推測雙腎草多糖對細胞免疫的作用不強，但還需進一步試驗進行證實。

本研究結果提示雙腎草多糖可顯著增加小鼠脾臟重量，促進抗體的產生，結合體重的變化可以認為雙腎草多糖對正常小鼠體液免疫具有一定的增強作用，表明該多糖對機體的的特異性免疫功能有一定的促進作用。

［1］中國科學院北京植物研究所.中國高等植物圖鑒(第五冊)［M］.北京：科學出版社，1976：1544.

［2］中國藥材公司.中國中藥資源志要［M］.北京：科學出版社，1994：1544.

［3］冉先德.中華藥海［M］.哈爾濱：哈爾濱出版社，1993：693.

［4］王文采.武陵山地區維管植物檢索表［M］.北京：科學出版社，1995：550.

［5］吳征鎰.新華本草綱要(第三冊)［M］.上海：上海科學技術出版社，1990：601.

［6］邱紅梅，張穎，周岐新，等.白芨多糖對小鼠免疫功能的調節作用［J］.中國生物制品學雜志，2011，24(6)：676－678.

［7］Lai CY，Hung JT，Lin HH，et al.Immunomodulatory and adjuvant activities of a polysaccharideextract of Ganoderma lucidum in vivo and in vitro［J］.Vaccine，2010，28(31)：4945－4954.

［8］張慶，雷林生，楊淑琴，等.大棗中性多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響［J］.第一軍醫大學學報，2001，21(6)：426－428.