苗醫驗方“四大血”抗炎、鎮痛作用研究△

田振華 謝達莎 包雪愛 張 斌 張 遜

(貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002)

“四大血”是在民族醫藥調研工作中搜集到的一個苗藥驗方，該方在黔北、川南、渝南山區廣為流傳，其治癥廣泛，常用于治療風濕疼痛，跌打損傷、血瘀月經不調、癱瘓等病癥，是苗醫通氣散血治療法的代表性方劑［1］。“四大血”由苗藥nangx dlob ghat(仰嗟嘎)、hsob hxangt(梭向)、ghab jongx bel sob xok(嘎龔布梭學)和vob mongb dlenb(萵蒙棱)等藤本藥材以一定比例組成。廣泛用于治療氣阻血瘀所引起的各種病癥，為苗醫常用驗方。本課題通過二甲苯致小鼠耳腫脹、棉球致小鼠肉芽腫及扭體法、熱板法等藥理實驗對該方的水提物和醇提物進行了抗炎、鎮痛的藥理研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：昆明種小鼠，體重18～22g，SPF動物，許可證號為SCXK(渝)2007－0006，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供。飼養條件：室溫20～25℃，相對濕度50% ～60%。予固體飼料，自由飲水。

1.2 實驗藥液制備

1.2.1 醇提液制備：按“四大血”處方比例分別稱取藥材并粉碎成粗粉，用75%乙醇加熱回流提取三次，合并濾液，回收乙醇至無醇味，繼續濃縮至干，粉碎過120目篩備用。經計算干粉相當于原生藥7.583g/g。臨用時取干粉用蒸餾水加適量吐溫－80配制成所需濃度的混懸液即可。

1.2.2 水提液制備：按“四大血”處方比例分別稱取藥材并粉碎成粗粉，用自來水煎煮3次，合并濾液。濃縮至2g/ml原生藥，臨用時加蒸餾水配制成相應的濃度即可。

1.3 藥品與試劑：“四大血”的水、醇提取物均由本課題成員制備(提取方法見1.2)。痛舒膠囊(TSJN，下同)，國藥準字Z2005478，批號：090507(云南藥物研究所制藥廠)，臨用時用蒸餾水配制成溶液使用。0.9%氯化鈉注射液，批號：090826(貴州科倫藥業有限公司)。所用試劑0.6%醋酸，二甲苯，0.1%伊文思藍，1%角叉菜膠，3%戊巴比妥鈉等由貴陽中醫學院藥理教研室提供。

1.4 儀器：電子天枰(BS110S型，北京賽多利斯儀器系統有限公司)，YLS6B智能熱板儀(上海特惠儀器設備有限公司)，TG16－W型離心機(上海隆白生物科技有限公司)，752紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，數顯游標卡尺(中美得力工具有限公司)。

2 實驗方法

2.1 抗炎作用研究

2.1.1 對二甲苯致小鼠耳廓炎癥的影響［2］：取體重18～22g昆明種小鼠80只，雄性，隨機分成8組，每組10只。第1組為陰性對照組，每只動物給予等體積的生理鹽水;第 2、3、4 組按 4.0g/kg，2.0g/kg，1.0g/kg 原生藥的高、中、低劑量給予“四大血”水提物;第 5、6、7 組按 0.3g/kg，0.2g/kg，0.1g/kg的高、中、低劑量給予“四大血”醇提物，第8組為陽性對照組，每只動物按0.4g/kg的劑量給予TSJN溶液;灌胃給藥，每日1次，連續3d。于末次給藥45 min后，用微細針管將二甲苯0.04ml/只均勻涂在右耳前后兩面致炎，40 min后頸椎脫臼法處死小鼠，立即剪下雙耳，用直徑8mm打孔器分別在左右耳相同部位取下耳片，用電子分析天平稱重。以左右耳差值作為腫脹度，并按下式計算抑制率(%)。

2.1.2 對小鼠棉球肉芽腫增生的影響［3］：取體重18～22g的昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為8組，分組與給藥方式同2.1.1。給藥前腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉小鼠，仰臥固定，酒精消毒下腹部皮膚，沿腹中線剪開長約0.5cm切口，將2個滅菌棉球(每個棉球重10mg，高壓滅菌，分別滴加800u/ml青霉素和650u/ml鏈霉素各0.05ml，50℃烘干)分別植入小鼠左、右蹊部皮下。術后當日開始給藥，每日1次，連續7d。末次給藥后1h脫頸處死動物，將棉球連同周圍結締組織一起取出，剔除脂肪組織，于80℃烘箱12h烘干，冷卻后稱重。干重減去原棉球重量，即得肉芽組織重量。肉芽腫指數以mg(肉芽腫)/10g(體重)表示。

2.1.3 對小鼠毛細血管通透性的影響［4］：取體重18～22g的昆明種小鼠80只雄鼠，隨機分為8組，分組與給藥方式同2.1.1，連續給藥3d。于末次給藥后40 min，尾靜脈注射1%伊文思蘭0.1ml/10g，同時腹腔注射0.6%醋酸0.2ml/只，20min后脫頸處死，剪開腹腔用10ml生理鹽水反復沖洗腹腔，用吸管吸取腹腔洗出液，于 3000r/min離心10min，取上清液，用分光光度計于590nm處測吸光度。

2.2 鎮痛作用研究［4］

2.2.1 對小鼠痛閾的影響 熱板法：取體重18～22g的雄性昆明種小鼠，于實驗前將小鼠放在55±0.5℃的熱板上測痛閾值，以小鼠舔后足為痛閾出現指標。凡痛閾值超過30s或低于5s的小鼠淘汰。用此法選出痛閾值在5s～30s之間的小鼠80只，隨機分為8組，分組與給藥方式同2.1.1。將選出的小鼠按上述方法重復測定其痛閾值。將每只小鼠所測兩次痛閾值平均后，作為其給藥前的痛閾值。每日給藥1次，連續3d，測定末次給藥后30 min，60 min，90 min的痛閾值，若小鼠在熱板上60s內仍無痛覺反應，立即取出按60s計，比較各組間痛閾值差異。

2.2.2 對小鼠扭體反應的影響：取體重18～22g的雌性昆明種小鼠，隨機分為8組，分組與給藥方式同2.1.1，每日1次，連續給藥3d，末次給藥后30min，各鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2ml，觀察小鼠的痛閾及扭體出現的時間，以腹部收縮內凹、軀體扭曲、后肢伸展、臂部高舉為指標，記錄15 min內各組的扭體次數，并按下式計算各組的抑制率。

2.3 統計學處理各組數據以±S表示，用t檢驗測驗其組間差異。

3 結果

3.1 抗炎作用

3.1.1 對二甲苯致小鼠耳廓炎癥的影響：“四大血”水、醇提取物高、中劑量組，對二甲苯誘發的小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用，與生理鹽水組比較具有顯著差異(P＜0.05;P＜0.01)，其作用與TSJN相當，而作用強度與給藥劑量呈現一定的相關性。結果見表1。

表1 “四大血”對小鼠二甲苯耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

表1 “四大血”對小鼠二甲苯耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

注：①與生理鹽水組比較*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01。

生理鹽水 — 16.0±1.63 28.75——水 提 物 4.0 11.6±2.07＊＊ 27.50 2.0 11.9 ±1.77＊＊ 25.63 1.0 14.6 ±2.38 8.75醇 提 物 0.3 11.7±2.04＊＊ 26.88 0.2 11.5 ±2.51* 28.13 0.1 13.8 ±1.51 13.75 TSJN 0.4 11.4 ±2.15＊＊

3.1.2 對小鼠棉球肉芽腫增生的影響：“四大血”水、醇提取物各組的肉芽重量和肉芽指數均有所降低，與生理鹽水組比較具有顯著性意義(P＜0.05;P＜0.01)，而作用強度與給藥劑量呈現一定的相關性。其中醇提物高劑量組的作用明顯高于TSJN組(P＜0.05)。提示“四大血”醇與水提取物對小鼠棉球肉芽組織增生的慢性炎癥有明顯的抑制作用，其作用與劑量呈正相關。結果見表2。

表2 小鼠棉球肉芽腫實驗(±s，n=10)

表2 小鼠棉球肉芽腫實驗(±s，n=10)

生理鹽水 — 30.60±2.006 12.81±1.289—20.92水 提 物 4.0 23.00±1.732＊＊ 8.81±1.035＊＊ 24.84 3.0 25.15 ±3.172＊＊ 10.00 ±1.409＊＊ 17.81 2.0 29.30 ±3.157* 11.06 ±2.022* 4.25醇 提 物 0.3 21.55±1.800＊＊△ 8.44±1.722＊＊△ 29.60 0.2 23.60 ±2.054＊＊ 7.34 ±1.189＊＊ 22.90 0.1 28.10 ±3.053* 10.63 ±1.944* 8.20 TSJN 0.4 24.20 ±3.276＊＊ 9.28 ±1.154＊＊

注：①與生理鹽水組比較*P＜0.05;＊＊P＜0.01。②與TSJN 比較△P＜0.05。

3.1.3 對小鼠毛細血管通透性的影響：“四大血”水提物和醇提物對醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性增加均有抑制作用，其中水與醇提物的高、中劑量組與生理鹽水

表3 四大血”對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響(±s，n=10)

表3 四大血”對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響(±s，n=10)

注：①與生理鹽水組比較*P＜0.05;＊＊P＜0.01②與TSJN比較△△P ＜0.01。

生理鹽水 —0.60 ±0.062水 提 物 4.0 0.48 ±0.071＊＊2.0 0.51 ±0.071＊＊1.0 0.57 ±0.065醇 提 物 0.3 0.38 ±0.047＊＊△△0.2 0.53 ±0.060*0.1 0.55 ±0.075 TSJN 0.4 0.51 ±0.044＊＊

組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，且醇提物高劑量組作用明顯高于TSJN組(P＜0.01)。提示“四大血”的水、醇提取物能拮抗醋酸引起的血管通透性增加，尤以醇提物高劑量組作用最強。結果見表3。

3.2 鎮痛作用

3.2.1 對小鼠痛閾(熱板法)的影響：“四大血”水、醇提物組的各劑量組藥后60 min痛閾值均有不同程度的提高，其痛閾值的變化與劑量呈現一定的相關性。其中水提取物的中、低劑量組給藥60與90 min后與生理鹽水組比較具有顯著性意義(P＜0.05;P＜0.01)。而醇提物高、中、低劑量組的痛閾值均有提示“四大血”對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。結果見表4。

表4 －1“四大血”對小鼠痛閾(熱板法)的影響(±s，n=10)

表4 －1“四大血”對小鼠痛閾(熱板法)的影響(±s，n=10)

注：①與生理鹽水組比較*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01②與 TSJN比較△P ＜0.05;△△P ＜0.01。

生理鹽水 — 13.75±1.70 13.83±3.802 13.28±2.824 14.50±3.588 15.12 ±2.973水 提 物 4.0 14.11 ±2.421 15.99 ±2.513 17.18 ±2.834* 17.76 ±3.625 17.54 ±4.347 2.0 13.31 ±3.71 17.05 ±5.794 23.29 ±3.761＊＊△△ 19.77 ±3.628＊＊ 19.60 ±2.067＊＊△△1.0 13.55 ±2.625 16.32 ±2.343 21.59 ±4.173＊＊△ 19.84 ±3.455＊＊ 18.3 ±1.997*醇 提 物 0.3 14.32 ±2.294 15.87 ±2.566 20.2 ±2.401＊＊ 16.99 ±1.905 15.09 ±4.207 0.2 12.38 ±1.947 16.06 ±3.802 19.24 ±5.527＊＊ 20.11 ±3.967＊＊ 17.95 ±3.502 0.1 13.48 ±2.159 14.87 ±2.467 18.66 ±3.629＊＊ 18.61 ±3.313* 18.55 ±4.085*TSJN 0.4 13.43 ±2.085 14.78 ±2.96 18.57 ±1.777＊＊ 18.86 ±2.468＊＊16.94 ±2.547

表4 －2“四大血”對小鼠痛閾(熱板法)的影響(±s，n=10)

表4 －2“四大血”對小鼠痛閾(熱板法)的影響(±s，n=10)

TSJN 0.4 13.32 21.75 25.87 24.31水提物 4 29.73 55.41 62.44 44.99 2 10.31 38.42 38.06 37.61 1 10.05 38.27 40.43 26.14醇提物 0.3 27.76 74.98 48.01 47.26 0.2 20.44 59.34 46.21 35.06 0.1 10.82 41.06 18.65 5.38

3.2.2 對小鼠扭體反應的影響：“四大血”水提物高、中劑量組和醇提物各組對醋酸小鼠扭體次數均少于生理鹽水組，統計學上存在明顯差異，且抑制作用與劑量呈正相關性。但出現扭體的時間未見明顯差異。結果見表5。

表5 “四大血”對小鼠扭體反應的影響(±s，n=10)

表5 “四大血”對小鼠扭體反應的影響(±s，n=10)

注：與生理鹽水組比較*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01

生理鹽水264.3 ±49.63 29.8 ±2.57水提物 4 226.2±25.24 18.7±5.48＊＊ 37.25 2 251.8 ±54.33 19.1 ±4.98＊＊ 35.91 1 257.1 ±57.50 24.7 ±5.29* 17.11醇提物 0.3 247.1±21.85 21.3 ±3.23＊＊ 28.52 0.2 224.8 ±42.71 24.6 ±6.50* 17.45 0.1 244.5 ±40.71 23.8 ±8.50* 20.13 TSJN 0.4 284.1 ±51.18 16.7 ±6.20＊＊43.00

4 討論

風濕性疾病、跌打損傷、血瘀月經不調等疾病多有疼痛或炎癥表現，本課題在整體動物模型上，從抗炎、鎮痛等方面評價”四大血”的藥理作用。抗炎實驗顯示，“四大血”水、醇提取物高、中劑量組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、小鼠棉球肉芽腫均有明顯抑制作用，并能顯著降低小白鼠腹腔毛細血管通透性。提示“四大血”對急慢性炎癥有抑制作用。鎮痛實驗發現，“四大血”水、醇提取物各劑量組對乙酸腹腔注射引起的大面積深部疼痛和熱板所致的非特異性疼痛，均顯示有較好的抑制作用。腹腔注射乙酸所產生的疼痛為外周神經性疼痛，熱剌激引起的疼痛主要為中樞性疼痛。提示“四大血”水、醇提取物對中樞及外周神經性疼痛均具有一定的抑制作用。由此證實了苗族應用“四大血”治療多種炎癥及疼痛類疾病的抗炎和鎮痛療效。其組方特點及其配伍規律，還有待進一步研究。

［1］曾定倫，熊傳榘，等.苗藥方”四大血”形性特征與適應癥范圍［J］.中國民族醫藥雜志，2004，10(增刊)：153～154

［2］王志文，張愛國等.麝香烏龍丸抗炎及鎮痛藥理研究［J］.時珍國醫國藥，2007，18(3);584

［3］陳奇.中藥藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛生出版社，1993：356

［4］陳奇.中藥藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛生出版社，2006：300～368