1型人類免疫缺陷病毒tat基因重組分泌型真核表達載體的構建▲

趙麗娟 陳源紅 唐華英 韋紅玉 曾 怡

(右江民族醫學院微生物學與免疫學教研室，廣西百色市 533000)

1型人類免疫缺陷病毒tat基因重組分泌型真核表達載體的構建▲

趙麗娟 陳源紅 唐華英 韋紅玉 曾 怡*

(右江民族醫學院微生物學與免疫學教研室，廣西百色市 533000)

目的構建人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表達載體。方法聚合酶鏈反應(PCR)法從缺失pol基因的重組HIV-1基因組pNL4-3中擴增tat基因;將PCR獲得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表達載體分別用Hind III酶切;pSecTag2B載體片段經小牛堿性磷酸酶去磷酸化后，用T4 DNA連接酶將tat基因與pSecTag2B載體片段連接過夜并轉化感受態大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆質粒進行Hind III酶切鑒定，并利用Nco I酶切鑒定克隆的tat基因反向。最后選取正向tat基因克隆質粒送基因測序。結果PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上約320bp位置出現條帶，與預期的324bp大小一致;經Hind III和Nco I分別酶切鑒定，獲得2個正向克隆;正向克隆經測序，克隆的tat基因序列與Genbank中登記的HIV-1 tat基因100%同源。結論本研究方法可以成功地構建HIV-1 tat基因分泌型真核表達載體。

人類免疫缺陷病毒1型;tat基因;分泌型真核表達載體

人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)Tat蛋白是HIV-1的反式激活因子，有2個外顯子編碼。tat基因的第一個外顯子編碼為72個氨基酸，是Tat的反式激活活性區;第二個外顯子編碼為Tat蛋白的羧基端，包含一個RGD基序，是Tat蛋白與受體αvβ3和α5β1整合素結合的部位。Tat蛋白是HIV-1病毒復制所必需的反式激活因子，已有研究證實Tat蛋白與HIV-1 RNA 5'端啟動子上的反式激活反應元件(trans-activation responsive element，TAR)結合［1］，激活 HIV-1 長末端重復序列(long terminate repeat，LTR)，使其下游的基因得以表達，從而促進整個HIV-1轉錄的表達。Tat蛋白本身沒有分泌信號，但是當T細胞急性感染HIV-1而細胞尚未死亡或通透性尚未改變時，Tat蛋白可被釋放到細胞外間質，并可能作用于其他細胞或細胞內感染的其他病毒，發揮細胞轉化或激活病毒復制周期的作用。本研究旨在構建HIV-1 tat基因重組的分泌型真核表達載體，為進一步研究分泌型Tat蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、DNA模板 PCR擴增所用的模板為缺失pol基因的重組HIV-1基因組pNL4-3，由南京醫科大學盧春教授饋贈。分泌型真核表達載體pSecTag2B購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 試劑與儀器 根據GenBank中登記的HIV-1 tat基因設計PCR引物，并在PCR上、下游引物的5'端引入Hind III酶切位點，在上游引物5'端起始密碼子ATG前添加了一個KOZAK序列(GCCACC)以增強基因的表達。PCR引物序列(下劃線部分為Hind III酶切位點):P1 5'-AAG CTT GCC ACC ATG GAG CCA G-3'，P2 5'-AA G CTT CTA ATC GAA TGG ATC TG-3';預期片段大小為324bp。PCR引物均由上海捷倍思生物工程公司合成。Lammda DNA EcoR I+Hind III分子量標記、PCR所用試劑Taq DNA多聚酶及緩沖液、dNTP、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、小牛堿性磷酸酶購自Fermentas公司，100bp ladder DNA分子量標記為大連寶生物產品，感受態DH5α購自北京天根生化科技公司，質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自美國Omega公司。研究中主要使用下列儀器:1-15PK冷凍離心機(德國Sigma)，Mycycler PCR 儀(美國 Bio-Rad)，Chemidoc XRS型凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 tat基因的擴增及純化 取1 μL pNL4-3做模板，用PCR引物P1和P2，PCR擴增HIV-1 tat基因，PCR反應體系包括:引物P1 10pmoL;P2 10 pmoL;10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5 μL;MgCl22.5 mmol/L;dNTPs 每 種2.5 mmol/L;Taq DNA聚合酶 2單位;總反應體積50 μL擴增條件:預變性94℃ 5 min;按94℃ 1 min，59℃ 30 s，72℃1 min進行30個循環;最后72℃延伸5 min。取5 μL PCR反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察確認擴增成功。平衡酚:氯仿法純化剩余的PCR反應產物。

1.2.2 tat基因重組分泌型真核表達載體的構建 分別取1 μg PCR 產物和1 μg pSecTag2B，經 Hind III酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收DNA片段。T4 DNA連接酶16℃連接過夜后，轉化感受態DH5α，涂布含100 μg/mL氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的 LB 平板，37℃培養16～18 h。挑取4個生長的細菌克隆至含100 μg/mL Amp的LB液體培養基，37℃、250 rpm/min振蕩培養16～18 h。提取質粒，Hind III酶切初步鑒定。

1.2.3 tat基因重組分泌型真核表達載體中tat基因插入方向的鑒定及基因測序 經Hind III酶切初步鑒定為陽性的質粒，進一步用Nco I酶切進行重組的tat基因插入方向的鑒定。酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察

經酶切鑒定的正向克隆質粒送公司進一步進行序列測定。

2 結果

2.1 HIV-1 tat基因的擴增及純化 以pNL4-3質粒為模板，用引入限制性酶切位點的PCR引物，經PCR擴增并用1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約320bp處出現條帶，與預期的324bp大小基本一致。電泳結果見圖1。

圖1 PCR擴增HIV-1 tat基因

2.2 限制性酶切初步鑒定tat重組分泌型真核表達載體從4個細菌克隆提取的質粒用限制性內切酶Hind III酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳后，共有3個克隆在約320bp和約5200bp位置出現條帶，另有1個克隆未見目的基因條帶。電泳結果見圖2。

圖2 tat重組分泌型真核表達載體的酶切鑒定

2.3 tat基因重組分泌型真核表達載體中tat基因插入方向的鑒定及基因測序 在分泌型真核表達載體pSecTag2B中610nt、903nt、2110nt、2330nt位置共有 4 個 Nco I酶切位點，tat基因序列有1個Nco I酶切位點，如果pSecTag2B中正向插入 tat基因，經 Nco I酶切后可出現 108bp、220bp、293bp、1433bp、3439bp共5個DNA片段;如果tat基因是反向插入pSecTag2B 中，經 Nco I酶切后可出現 221bp、294bp、441bp、1121bp、3439bp共5個DNA片段。結果顯示，泳道2，3為正向克隆，泳道1為反向克隆。泳道2，3的正向克隆質粒送公司測序，結果顯示正向克隆的 tat基因序列與Genbank中登記的HIV-1 tat基因100%同源。

圖3 Nco I酶切鑒定重組分泌型真核表達載體中tat基因的插入方向

3 討論

在HIV-1感染的過程中，正常的宿主細胞始終暴露在游離的HIV-1病毒顆粒以及不斷在體內循環的HIV-1編碼蛋白中。雖然這些正常細胞不會被HIV直接感染，但是與HIV-1相關的蛋白接觸會對他們的基因表達以及正常功能產生深遠的影響。除了糖蛋白120(glycoprotein 120 gp120)，可溶性的HIV-1 Tat也由感染細胞分泌并且可以和靶細胞表面的 αvβ3 以及 α5β1 整合素結合［2，3］。該結合過程依賴于Tat蛋白羧基端的高度保守序列精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)，RGD與細胞表面受體的結合可誘導細胞內信號通路的活化，最終導致靶細胞基因表達的改變此外，細胞外Tat可與細胞膜非特異性結合并內化入細胞［2，4］。細胞內化的Tat蛋白可直接與細胞基因作用而改變基因表達。

在美國，有超過20%的AIDS患者同時患有卡波濟肉瘤(Kaposi's sarcoma，KS)，這類KS稱為 AIDS-KS。多項研究表明KSHV的感染與KS的發生密切相關，而HIV-1感染者更容易發生KS。本課題組先前的研究證實［5，6］，細胞內表達的Tat蛋白可激活潛伏的KSHV的復制周期，并促進Kaposin蛋白介導的類 KS腫瘤形成。探討 Tat蛋白在AIDS-KS發生機制中的作用，對研究AIDS-KS的預防和治療方法有重要意義。

本研究采用PCR法從缺失pol基因的重組HIV-1基因組pNL4-3中擴增tat全基因，利用Hind III單酶切并克隆入分泌型真核表達載體pSecTag2B中，進一步用Nco I對插入的tat基因進行插入方向的鑒定后，最后進行基因測序。測序結果與Genbank中登記的HIV-1 tat基因100%同源，表明我們獲得了正向插入的tat基因重組分泌型真核表達載體。由于我們未購買到抗Tat蛋白抗體，因此未能利用Western blot(WB)法進行Tat蛋白表達的檢測。在下一步的研究中，本項目組將采用基因轉染、WB、CAT-LTR ELISA的方法，將tat基因重組分泌型真核表達載體轉染293細胞，檢測構建的重組載體中tat基因在293細胞中表達的Tat蛋白，并進一步檢測表達的Tat蛋白的反式激活活性Tat蛋白分泌情況，最終驗證本研究構建的tat基因重組分泌型真核表達載體。該載體最終鑒定后可用于研究分泌型Tat蛋白在激活KSHV復制周期和促進AIDS-KS發生發展中的作用。

［1］ Barillari B，Ensoli B.Angiogenic effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1 tat protein and its role in the pathogenesis of AIDS-associated Kaposi's sarcoma［J］.Clinical Microbiology Reviews，2002，15(2):17.

［2］ Barillari G，Gerdelman R，Gallo KC，et al.The Tat protein of human immunodeficiency virus type 1，a growth factor for AIDS Kaposi sarcoma and cytokine-activated vascular cells，induces adhesion of the same cell types by using integrin receptors recognizing the RGD amino acid sequence［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(17):7941－7945.

［3］ Ensoli B，Barillari G，Salahuddin SI，et al.Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi＇s sarcoma lesions of AIDS patients［J］.Nature，1990，345(6270):84 －86.

［4］ Sood V，Ranjan R，Banerjea AC.Functional analysis of HIV-1 subtypes B and C HIV-1 Tat exons and RGD/QGD motifs with respect to Tat-mediated transactivation and apoptosis［J］.AIDS，2008，22(13):1683－1685.

［5］ Zeng Y，Zhang X，Huang Z，et al.Intracellular Tat of human immunodeficiency virus type 1 activates lytic cycle replication of Kaposi＇s sarcoma-associated herpesvirus:role of JAK/STAT signaling［J］.J Virol，2007，81(5):2401 －2417.

［6］ Chen X，Cheng L，Jia X，et al.Human immunodeficiency virus type 1 tat accelerates Kaposi sarcoma-associated herpesvirus Kaposin A-mediated tumorigenesis of transformed fibroblasts in vitro as well as in nude and immunocompetent mice［J］.Neoplasia，2009，11(12)1272－1284.

Construction of secretory eukaryotic vector of tat gene from human immunodeficiency type 1

ZHAO Li-Juan，CHEN Yuan-Hong，TANG Hua-Ying，WEI Hong-Yu，ZENG Yi(Department of Microbiology and Immunology of Youjiang Medical University For Nationalities，Baise 533000，China)

ObjectiveTo construct secretory eukaryotic expression vector of tat gene from human immunodeficiency type 1(HIV-1).MethodsHIV-1 tat gene was amplified from pNL4 －3 plasmid，which was HIV-1 genome deleted pol gene，with polymerase chain reaction(PCR).Tat DNA fragments and secretory eukaryotic expression vector，pSecTag2B were then digested with Hind III.Digested pSecTag2B fragments were further dephosphorylated with calf intestinal alkaline phosphatase(CIP).Digested tat DNA fragments and pSecTag2B fragments were ligated overnight with T4 DNA ligase and were further transformed to E.coli competent cells DH5α.Furthermore，recombinant plasmids were extracted and determined by digestion with Hind III restricted enzyme.Moreover，the direction of inserted tat gene in recombinant plasmids was detected with Nco I restricted enzyme.Consequently，plasmids from norientation clone were sequenced.ResultsA band about 320bp as expecting(324bp)was visible when PCR products were electrophoresis in 1%agarose.Digested with Hind III and Nco I enzyme respectively，2 positive norientation clone were determined.Thesequence of tat gene cloned in norientation plasmid was 100%homology with HIV-1 tat gene registered in GenBank.ConclusionHIV-1 tat gene can be cloned into secretory eukaryotic vector successfully.

Human immunodeficiency virus type 1;Tat gene;Secretory eukaryotic expression vector

R 349.83

A

1673-6575(2012)04-0347-04

廣西自然科學基金項目(桂科自0728246，桂科青0728105)，廣西教育廳項目(桂教科研［2006］26號200610LX123);右江民族醫學院項目(右醫科字［2007］2號);廣西百色市科學研究與技術開發計劃課題(百科計字［2006］13號)

趙麗娟(1967～)，女，碩士，副教授，研究方向:分子病毒學。

*通訊作者

2012-03-06

2012-04-28)