后循環缺血兔大腦后分水嶺區皮質MMP-9和TIMP-1表達的實驗研究

[摘要] 目的 研究動脈粥樣硬化兔在右鎖骨下動脈盜血模型建立下大腦后分水嶺區皮層中MMP-9和TIMP-1的動態表達變化情況。方法 30只動脈粥樣硬化兔，隨機分為對照組、盜血后1d組和盜血后3d組，每組10只；取大腦后分水嶺區皮層，采用熒光定量PCR技術檢測MMP-9和TIMP-1的基因表達，并進行比較。結果 MMP-9在盜血后1d及3d上升，但組間未見明顯統計學差異；TIMP-1表達在對照組最低，盜血后1d表達升高，在盜血后3d TIMP-1表達開始下降，但仍高于對照組。統計學處理后未發現組間有明顯統計學差異。結論 在該動脈粥樣硬化兔右鎖骨下動脈盜血模型中，分水嶺區皮層中MMP-9和TIMP-1的基因表達在模型建立后的1d和3d呈現血管重建啟動的變化趨勢，但差異無統計學意義。該動物模型引起MMP-9和TIMP-1的表達變化情況需要進一步實驗證實。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化；腦缺血；基質金屬蛋白酶-9；金屬蛋白酶組織抑制劑-1

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）23-07-10-02

Experimental Study on the Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the Cortex of Posterior Brain Watershed Area under the Condition of Posterior Circulation Ischemia

SHOU Tiejun1，2 CHEN Zuoquan3 ZHANG Guiyun4 WU Kun1

1.Medical College of Tongji University，Shanghai 200092，China；2.No. 1 Section of Surgery Department，Ningbo Women and Children’s Hospital，Ningbo 315012，China；3.Neurosurgery Department，No.10 Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200072，China；4.Neurosrugery Department，Tongji Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200065，China

[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes of MMP-9 and TIMP-1 in the cortex of the brain watershed area of the atherosclerosis rabbit of right subclavian atery steal model. Methods Thirty healthy male New Zealand white rabbits were randomly assigned to control group，one-day steal model group and three-day steal group （n=10）. With those killed and brain extracted the expressions of the gene of MMP-9 and TIMP-1 were measured by the technique of immunofluorescence PCR，and the differences among groups were analysed. Results As statistically showed，MMP-9 expression was a little higher in the three-day steal group than that in the one-day group，with both higher than that in the control group，although there was no significant difference among groups.TIMP-1 expression was the lowest in the control group，raised in the one-day steal group and began descending in the three-day steal group，but still higher than that in the control group. There was still no significant difference among groups. Conclusion In the right subclavian steal model of atherosclerosis rabbit，the gene and protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in the cortex of the brain watershed area in the ond-day steal group and three-day steal group take on a variation trend of vessel reconstruction start，while there is still no significant difference among groups. Whether this model can give rise to the change of the expressions of MMP-9 and TIMP-1 needs to be further proved through experiments.

[Key words] Atherosclerosis；Cerebral ischemia；MMP-9；TIMP-1

動脈粥樣硬化是引起腦卒中最常見的原因。腦動脈粥樣硬化主要發生在管徑500μm以上的動脈，其斑塊引起管腔狹窄或血栓形成，導致腦部血液供應障礙，腦組織缺血、缺氧性壞死，出現相應功能障礙。不同的血管病變引起的相應功能區病變也不相同。后循環腦梗死比其他部位梗死更容易致命，并且治療困難。實驗通過結扎新西蘭大白兔右側鎖骨下動脈的椎動脈開口近端，實現右側鎖骨下動脈盜血，降低椎基底動脈及遠端血管的灌注壓，模擬臨床動脈粥樣硬化患者由于動脈狹窄或閉塞導致的后循環低灌注狀態，并檢測后分水嶺區皮質MMP-9和TIMP-1基因的動態表達情況，探討新模型下腦缺血的分子機制，為臨床有效防治該病提供新的依據。

1 資料與方法

1.1#8195;動物飼養及模型建立階段

實驗于2010年4月完成設計并通過開題報告會。30只健康雄性新西蘭兔（體重2.5～3.0kg，）以1%膽固醇+5%蛋黃+5%豬油之高脂飲食配方喂養12周，結扎兔右側鎖骨下動脈的椎動脈開口近端[1]，模擬人動脈粥樣硬化后循環缺血的病理改變過程。

1.2 樣本提取階段

將上述兔分成盜血1d組、盜血3d組和對照組，每組10只，對照組飼養12周后處死，后循環盜血組分別在術后第1天、第3天處死，快速斷頭取腦，腦組織在生理鹽水中沖洗后，分別取右側分水嶺區皮層置入無菌凍存管，迅速放入液氮罐，深低溫保存待檢。

1.3 實驗室檢測階段

總RNA抽提：取綠豆大小的組織，放入加有800μL TRIzol的5mL離心管（RNA酶free）中，用組織高速分散器勻漿后，在管中加入160μL氯仿，蓋緊管蓋，用手混勻，使體系成粉色乳狀后，12000g離心15min；小心移取上清約400～450μL至新1.5mL管（RNA酶free）中，加入450μL異丙醇，混勻，置于-20℃冰箱助沉30min，12000g離心10min。小心地徹底棄上清。在離心管中加入1mL冰75%乙醇，輕彈管底使沉淀懸浮起來，12000g離心5min。小心地徹底棄上清，并于沉淀處畫圈標記。RNA干燥后，用30μL DEPC處理過的去離子水溶解后取1μL樣本與9μL 1X上揚緩沖液混勻后上樣電泳，其余于-80℃保存。TIMP-1引物序列：上游P5：5’-GCTGCTGCTGCTGTGGCTGGTAG，下游P5：5’-GCTGCTGCTGCTGTGGCTGGTAG；MMP-9引物序列：上游P5：5’-CGGAGACGGGGGAGCTGGATAATG，下游P3：5’-GCGCGGCAGGTCTTCGGAGTAGTT。內參照18s引物序列：上游5’-AGTCGCCGTGCCTACCAT-3’，下游5’-CGGGTCGGGAGTGGGTAAT-3’。采用試劑TAKARA DRR037：PrimeScriptreg;RT reagent Kit Perfect Real Time進行RNA的反轉錄，PCR擴增。定量檢測，熒光定量檢測結果采用slan熒光定量5.1軟件進行分析。

1.4 統計學處理

數據均以平均值±標準差表示，統計方法為參數分析方式。所有統計結果均采用SPSS13.0軟件中的完全隨機設計的單因素方差分析模塊（pos-hocone-way ANOVA），比較多重均數。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物結果

盜血實驗組均采用右鎖骨下動脈結扎法建立后循環缺血模型，無死亡、無神經系統功能障礙及行為等方面異常。實驗中發現，右鎖骨下動脈結扎法建立的后循環缺血模型是可行的，具有重復性。

2.2 實驗數據與分析（表1）

以上各組數值均為所測值與18s（內參照）的比值，故沒有單位；MMP-9組間比較，差異無統計學意義（F=0.033，P=0.968＞0.05）；TIMP-1組間比較差異無統計學意義（F=0.812，P=0.455＞0.05）。

3 討論

MMP-9是一種相對分子質量為92KD的鋅依賴性內肽酶，通過作用于Ⅳ型明膠、層粘連蛋白和纖維粘連蛋白，在細胞外基質的降解和重塑中起著重要的作用[21]。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑。MMP-9與TIMP-1的動態穩定對于維持細胞外基質的穩態非常重要；在腦缺血、缺氧、炎癥等病理誘因下，這一穩態被破壞，MMP-9過量產生，血管通透性增加，細胞外基質被過度降解，導致腦水腫等發生。而動脈粥樣硬化下的腦缺血的發生，其側支循環的建立狀況直接影響到缺血區血液供應的恢復程度和速度，改善組織細胞的氧和營養物質的供應，有利于缺血性腦血管疾病的治療和康復。同時，側支循環的建立主要在于動脈生成。動脈生成是指原有的阻力型小動脈在動脈閉塞等病理條件下，管腔擴大，管壁重塑，轉變為供血型側支動脈的過程，其所形成的動脈能夠有效地恢復動脈阻塞所致缺血區的血液供應[2，3]。基質金屬蛋白酶及其抑制劑能夠使細胞外基質降解、促進內皮細胞動員而利于細胞遷移，參與動脈生成。因此，通過對腦缺血下MMP-9和TIMP-1表達的實驗研究有助于探討其在側支循環建立過程中的分子機制。

近些年來有關MMP-9在急性腦梗死中的表達、作用的研究非常多，與之相應的腦缺血模型（如大腦中動脈盜血模型MCAO）報道也比較多，為基礎和臨床研究提供了很多的實驗依據。而右側鎖骨下動脈盜血模型[4]，模擬了臨床動脈粥樣硬化患者由于椎基底動脈狹窄或閉塞導致的后循環低灌注狀態，用來研究椎基底動脈系統（即后循環）缺血下分子機制，為臨床有效防治該病提供新的依據。

動脈粥樣硬化是導致大動脈狹窄或閉塞的重要原因，在右鎖骨下動脈結扎后，血流動力學異常，后循環灌注壓下降；分水嶺區為位于大腦皮質動脈供血區之間、基底節區小動脈供血區之間的邊緣帶組織，低血流灌注下更易產生缺血、梗死，同時由于前循環的部分代償減弱了缺血強度，加之時間窗的選取不足以表現出MMP-9的變化，結合例數較少，因此在本次研究中，MMP-9在對照組、盜血1d組和盜血3d組的表達呈現了逐漸升高的趨勢，但是各組間比較在統計學上沒有顯著性意義。與近年來文獻中有關MMP-9的動態變化相符合[5-8]。TIMP-1在盜血第一天達到了很高的表現，之后逐漸下降，但仍比對照組高，而在統計學上沒有顯著性差異。

綜合以上分析，有關右側鎖骨下動脈盜血模型下的更多的分子機制的表現有待今后通過增加樣本量和取樣時間窗，引入基質金屬蛋白酶家族中的其他成員，進行進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] MunBryce S，Rosenberg GA．Celatinase B modulates selective opening of the Blood-brain barrier during inflammation[J]．Am J Physiol，2002，274（5 pt 2）：R1203.

[2] Hershey JC，Baskin EP，Glass JD，et al. Revascularization in the rabbit hindlimb： dissociation between capillary sprouting and arteriogenesis[J]. Cardiovasc Res，2001，49：618-625.

[3] Helisch A，Schaper W. Arteriogenesis：the development and growth of collateral arteries[J]. Microcirculation，2003，10：83-97.

[4] 張桂運，陳左權，凌鋒，等. 動脈粥樣硬化兔鎖骨下動脈盜血模型的建立[J].中國腦血管病雜志，2009，6（7）：355-358.

[5] 王新，黃如訓，曾進勝. 腦梗死急性期血清MMP-9的動態變化及其與腦梗死分型關系的研究[J]. 中國神經精神疾病雜志，2005，31（1）：20-23.

[6] 吉訓明，段麗芬，朱榆紅，等. 大鼠頸動脈狹窄伴多發腦梗死血管再通后腦組織MMP-9的動態變化[J]. 中風與神經疾病雜志，2009，26（2）：132-135.

[7] 于福生，趙仁亮，董志勇. 急性腦梗死患者血清基質金屬蛋白酶-9的變化研究[J]. 河北醫藥，2010，32（20）：2808-2810.

[8] Jayaraj RA，Mona A，Nimesh G，et al. Alteration of blood brain barrier permeability by T-2 toxin：Role of MMP-9 and inflammatory cytokines[J]. Toxicology，2011，280：44–52.

（收稿日期：2011-05-17）