新城疫病毒(NDV)對卵巢癌細胞株(SKOV-3)的殺傷作用

[摘要] 目的 研究新城疫病毒（NDV）對卵巢癌細胞株（SKOV-3）的殺傷作用。方法 用不同濃度新城疫病毒（NDV-D90）與卵巢癌細胞株（SKOV-3）共培養；在不同時間（6、12、24、48h）觀察SKOV-3細胞形態的改變。結果 NDV病毒作用的SKOV-3細胞表現為細胞膜皺縮、細胞核染色質濃縮、細胞溶解和細胞凋亡；NDV可對SKOV-3胞產生抑制作用，抑制效果與濃度及共同孵育時間有關，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 NDV對體外培養SKOV-3細胞增殖有明顯抑制作用，并可誘導該細胞凋亡。

[關鍵詞] 卵巢癌；NDV；細胞培養

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）23-25-02

The Effect of Newcastle Disease Virus-infected（NDV） on the SKOV-3

SU Lirong

Obstetrics and Gynecology Department，Beijing Municipal Shunyi District Women and Children Health Care Hospital ， Beijing 101300，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of newcastle disease virus-infected（NDV） on the SKOV-3. Methods NDV-D90 in different concentration was cultured with SKOV-3； The SKOV-3 cells were monitored for cell morphological changes under micro scope within 6hours， 12hours，24hours and 48hours respectively. Results The SKOV3 cells infected by NDV become shrinked，dissolved. Cell concentration and apoptotic bodies were observed as well. NDV could effectively inhibit SKOV-3 cell growth， which depends on virus concentration and inoculation time of NDV and the difference of cell growth inhibitory rate among cells was significant（P＜0.01）. Conclusion NDV can inhibit proliferation and induces cell apoptosis in SKOV-3 cells in vitro.

[Key words] Ovarian cancer； NDV；Cell culture

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，且手術和放化療療效不佳，5年生存率較低，成為嚴重威脅婦科腫瘤患者生命的疾病。卵巢癌傳統的治療常難以治愈，且易復發。因此尋找特異性強、敏感性高的卵巢癌相關抗原，并探索有效的綜合治療方法有重要的臨床意義。腫瘤基因治療給腫瘤治療技術帶來了新生機，供選擇的基因有[1]：細胞因子基因、主要組織相容性復合體基因、病毒基因和反義基因。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是近年來興起引起重視的一種病毒，作為病毒基因，它對多種惡性腫瘤具有一定治療作用。 2010年3月~ 2011年1月本研究對此課題進行探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腫瘤細胞株卵巢癌細胞株SKOV-3購自哈爾濱市腫瘤醫院細胞生物所；主要試劑新城疫病毒（NDV-D90）、胎牛血清、RPMI1640培養液、臺盼藍、AO-PI染劑；實驗儀器超凈工作臺（蘇州凈化集團安泰公司）；CO2細胞培養箱（上海躍進醫療器械廠）；倒置顯微鏡（OLYMPUS-CK2，Japan）；自動雙重純蒸餾水器（上海強申生化儀器廠）；電熱恒溫水浴箱（北京醫療設備廠，GB11241-89）；透射電鏡（日產JEM-1230型）；熒光顯微鏡；光學顯微鏡（OLYMPUS，Japan）；離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養細胞用RPMI1640培養基，加入10%小牛血清、100U/mL青霉素及鏈霉素100μg/mL，細胞呈貼壁生長。于37℃、5%CO2飽和濕度條件孵箱孵育，每2～3天換液一次。傳代培養時，將處于對數生長期的細胞棄盡培養液，加入新鮮的0.25%胰酶消化37℃孵育5min，待細胞脫壁后加入新鮮的含小牛血清的培養液中止胰酶反應，抽提重懸細胞，分置細胞于新的培養瓶中，傳代比例為1∶3；制成細胞懸液，離心后加培養液10mL重懸細胞，取0.5mL進行活細胞計數，反復計數三次， 分裝于培養瓶中，放入孵育箱中備用。生理鹽水洗滌兩次，將細胞調整為4×107/mL。

1.2.2 受試藥物的配置 NDV在雞胚尿囊液中培養擴增，置37℃恒溫箱中72h后取出，4℃冰箱過夜，7520rpm離心15min，取上清液，用HBSS液溶解沉淀，雙蒸水稀釋蔗糖成20%~55%梯度，在4℃，75000rpm離心2h，從蔗糖界面抽吸出純化的病毒，測定NDV濃度為2×108PFu/mL，用PBS液稀釋為108PFu/mL，將病毒分裝凍存。NDV-D90是一種新分離強毒株，血凝效價2×108PFU/mL和2×109PFU/mL，由哈爾濱獸醫研究所提供。實驗分組和處理將制備好細胞懸液分5個處理組分別接種于培養瓶、6孔培養板和96孔板上，盡量吹打均勻，并做對照，再分別加NDV病毒原液500μL（約含病毒顆粒2×108/PFU）放于37℃、5%CO2培養箱中，分別于6h、12h、24h、48h分別觀察細胞生長及死亡情況，并用臺盼藍染色計數死細胞數，計算細胞存活率。培養24h取出6孔培養板固定，曬干24h中性樹脂封片備用。NDV稀釋10倍組：NDV50μL稀釋10倍，其余同NDV原液組。NDV稀釋100倍組：NDV5μL給予稀釋100倍，其余同NDV原液；光學顯微鏡觀察腫瘤細胞的凋亡和計算貼壁率，臺盼藍檢測腫瘤細胞存活率， 細胞存活率（%）=（細胞總數-藍色細胞數）/細胞總數×100%；AO-PI染色法（丫啶橙染色法及活細胞染色）進行形態觀察和指標檢測，熒光檢測細胞凋亡。電鏡檢查當CPE（細胞病變試驗）達80%棄去維持液，用橡皮墊掃刮取細胞，收集于5mL的EP管中固定，3000r/min離心10min，送電鏡室透射電鏡觀察細胞內病毒顆粒和細胞超微結構變化。凋亡細胞半定量分析400高倍視野下，每個培養瓶拍攝5個陽性視野，每視野計數200個腫瘤細胞中的陽性細胞數，以平均計算陽性細胞數所占的百分比作為凋亡細胞陽性指數[（AI）=（凋亡陽性的細胞核數÷總計數的細胞核數）×100]。

1.3 結果判定

吖啶橙染色后熒光顯微鏡下見NDV作用的癌細胞細胞質與細胞核呈致密濃染的黃綠色熒光或見黃綠色碎片，亦有少數黃綠色碎片，染色質濃縮到核邊，核碎裂，有的細胞形成合胞體；PI染色熒光顯微鏡下見正常活細胞核被PI著染呈紅色；早期凋亡細胞胞核濃縮，染色加深，或核染色質聚集于核膜一邊，呈新月狀；晚期凋亡細胞胞核碎裂成大小不等的原形小體，并被細胞膜所包繞，即凋亡小體。病毒作用24h后電鏡下觀察細胞中發現凋亡小體，同時也見典型的壞死細胞。

1.4 統計學方法

采用SPSS統計軟件進行數據處理，運用配對t檢驗或χ2檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 新城疫病毒（NDV）對人卵巢癌細胞株（SKOV-3）不同作用時間殺傷作用

腫瘤細胞貼壁率光鏡選擇3個視野觀察腫瘤細胞貼壁率，隨NDV作用時間的延長，腫瘤細胞萎縮、脫落、最后懸浮，貼壁率顯著下降（表1）。

2.2 兩組腫瘤細胞存活率與貼壁率相比

腫瘤細胞存活率與貼壁率相比，存活率高于貼壁率，實驗組與對照組存在顯著性差異（P＜0.01）。

2.3 腫瘤細胞的光鏡觀察

NDV病毒處理24h后人卵巢癌細胞株SKOV-3見細胞體積減少細胞膜皺縮，形態不規則，溶解核小體出現，核染色質濃縮在核膜下或核的一邊， 可見細小的碎片，出現大面積細胞凋亡。未經NDV病毒處理的SKOV-3細胞只見少許凋亡細胞。

2.4 電鏡檢查

感染病毒48h細胞作超薄切片、透射電鏡觀察，見NDV作用后SKOV3細胞形態改變，腫瘤細胞感新城疫病毒后，可引起明顯的細胞超微結構變化：細胞胞漿內均富含不同發育階段的病毒顆粒，完整病毒粒直徑約100nm，并形成包涵體；成熟病毒粒子排列成晶格狀，線粒體腫脹、細胞膜溶解；亦見到核膜結構完整，但核染色質濃縮、成塊、邊聚、滑面內質網擴張的細胞，尚可見到大量的病毒空衣殼和未包裝的病毒核物質。見圖1。

圖1 NDV 誘導SKVO-3細胞發生細胞凋亡的形態改變（×50 000）

A：未感染NDV的SKOV-3細胞； B：NDV作用48h的SKOV-3細胞；C：未感染NDV的SKOV-3細胞；D：NDV作用48h的SKOV-3細胞

2.5 AO-PI染色法檢測凋亡細胞

AO-PI染色法檢測凋亡細胞感染病毒24h的細胞經AO-PI染色法后，腫瘤細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色。新城疫病毒作用24h凋亡細胞陽性指數（AI）為9.9%，48h凋亡細胞陽性指數（AI）為17.8%。

3 討論

NDV 是新城疫病毒（NDV），屬副黏病毒科腮腺炎病毒屬成員，屬反義負鏈RNA病毒，由 Doyle[2]在1927 年首先發現和分離報道。本研究將NDV與人卵巢癌細胞株混合，研究其對人卵巢癌細胞株和正常人卵巢上皮細胞的生長抑制作用。結果表明NDV對人卵巢癌細胞有抑制作用，對人正常卵巢上皮細胞作用不明顯，提示NDV在體內可能有安全性好、副反應小的優越性。NDV對絕大多數腫瘤有選擇性直接殺傷作用，國外將NDV應用于臨床未發現毒性反應。本實驗進一步確定新城疫病毒的抗腫瘤作用，直接用新城疫病毒觀察其體外抗腫瘤作用，研究表明，新城疫病毒在體外可抑制瘤細胞的存活。NDV對卵巢癌有直接的抑瘤作用，使NDV有望在控制卵巢癌微小殘余灶、延緩復發、提高生存期和生存質量等方面發揮作用。NDV具有直接誘導腫瘤細胞凋亡及激活免疫功能細胞，NDV誘導腫瘤細胞凋亡或瘤體消退的機制尚不十分清楚，可能的解釋：①NDV直接作用于腫瘤細胞產生細胞毒作用，病毒選擇性地作用于腫瘤細胞，對正常組織細胞不起作用。Tzadok-David等[3]研究了NDV對Burkitt淋巴瘤Daudi細胞的破壞作用，發現NDV對腫瘤細胞的裂解機制可能與細胞膜的通透性增加有關。② NDV蛋白與腫瘤細胞膜部分或完全融合，誘導和加強宿主的細胞免疫及體液免疫殺傷腫瘤細胞。③NDV對體內外巨噬細胞抗腫瘤活性具有很強的激活作用；NDV能選擇性地感染腫瘤細胞并在其中復制，不感染正常細胞。本實驗利用NDV-D90強毒株作用于人卵巢癌SKOV3，發現NDV有明顯的抑制腫瘤作用。蔣文軍等選用NDV Lasota毒株感染多個人惡性腫瘤細胞株，亦得出相同結果。

綜上，新城疫病毒（NDV）促進SKOV3卵巢癌細胞凋亡，對卵巢癌組織具有溶瘤作用，使新城疫病毒成為手術、化療之外的新選擇。

[參考文獻]

[1] 成軍.抗腫瘤基因治療的目的基因選擇[J]. 國外醫學：腫瘤學分冊，1994，21（1）：6.

[2] 陳兆.醫學分子生物學[M].武漢：武漢大學出版社，1987：50-52.

[3] Fabian Zm，Torocsik B，Kiss K. Induction of apoptosis by a New-ca-stle disease virus vaccine （MTH-68/H） in PC12 rat phaeochromocyt-oma Cells[J].Anticancer Res，200l， 22（14）：125.

[4] Pavel I. Nedvetsky， William C. Sessa，and Harald HH W. Schmidt. There's NO binding like NOS binding：Protein-protein interactions in NO/cGMP signaling[J].PNAS， 2002， 99 （26）： 16 510-16 512.

[5] 蔣文軍，魏陽新.新城疫病毒Lasota弱毒株對人腫瘤細胞的體外修飾作用[J].腫瘤防治研究，2007，34（4）：281-283.

（收稿日期：2011-05-23）