二十碳五烯酸抑制肺腺癌A-549細胞株增殖

[摘要] 目的 在體外細胞實驗中，觀察二十碳五烯酸（EPA）聯合順鉑（DDP）對肺腺癌A-549細胞株的抗增殖和誘導凋亡作用。方法 選用A-549細胞株進行體外培養，用MTT比色法測定EPA對A-549細胞株的抗增殖作用。應用倒置顯微鏡、光學顯微鏡觀察細胞凋亡形態學變化。應用TUNEL染色法檢測細胞凋亡指數（AI）。結果 實驗結果表明，EPA在（60～120）μg/mL濃度范圍內，于24、48、72、96h四個時間段對肺腺癌A-549細胞株均有抑制生長作用，且EPA與順鉑有協同抗癌作用，并表現出濃度、時間依賴性關系。當EPA濃度為60、80、100、120μg/mL時，細胞凋亡指數（AI）依次升高，分別為（81.52±1.96）%、（83.74±2.21）%、（85.30±2.38）%、（86.26±2.44）%，不同濃度組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 體外實驗中，EPA對A-549細胞生長有抑制作用，呈明顯的量效和時效關系，且與順鉑有協同作用。

[關鍵詞] 二十碳五烯酸；增殖；肺腺癌；A-549細胞株

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）23-07-03

The Effect of Inhibiting Hyperplasia of Eicosapentaenoic Acid on A-549 Human Lung Cancer Cell Line

MA Liujiang AN Jinghua LI Xing SHI Jun

The Affiliated Hospital of Yanbian University， Yanji 133000， China

[Abstract] Objective To observe the effects of anti-proliferation and inducing apoptosis on A-549 cell line induced by eicosapentaenoic acid （EPA） and its synergistic effect with cisplatin （DDP） in vitro. Methods A-549 cell line was cultured in vitro. MTT assay was used to determine the growth inhibitory effect of EPA on A-549 cells. Morphological changes of the apoptosis of A-549 cells were observed by using inverted microscope. TUNEL was used to detect cell cycle distribution and apoptotic rate of A-549 cells. Results The results of experiments showed that when A-549 cells were exposed to EPA for 24h， 48h， 72h and 96h respectively at final concentration of （60-120） μg/mL， the growth of cells was inhibited and showed in dose and time dependent manner. EPA combined with DDP showed significant synergistic anti-tumor effect on A-549 cells. When the concentration of EPA altered from 60μg/mL to 120μg/mL， the apoptotic index （AI） of A-549 cells elevated accordingly by the method of terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling （TUNEL）， the apoptotic indexes were （81.52±1.96）%， （83.74±2.21）%， （85.30±2.38）%， （86.26±2.44）% respectively and showed statistical significance compared between different concentration （P＜0.05）. Conclusion EPA inhibits growth of A-549 cell line in vitro in dose and time dependent manner; EPA combined with DDP shows significant synergistic anti-tumor effect on A-549 cell line.

[Key words] Eicosapentaenoic acid; Hyperplasia; Lung adenocarcinoma; A-549 cell line

目前各種腫瘤已成為威脅人類健康的第一位死因[1，2]，并且腫瘤的發病有逐年增加和年輕化的趨勢。在已經完成的研究中表明，腫瘤細胞與正常組織細胞在脂質代謝有本質區別，腫瘤細胞質中可出現糖脂減少等[1，3-6]。因此，在腫瘤的治療中，可以利用不飽和脂肪酸作為探針，聯合抗腫瘤藥物來進行抗腫瘤治療。2008～2010年我們應用ω-3不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸（EPA）聯合順鉑（DDP）共同作用于肺腺癌A-549細胞株，繼續觀察更大劑量的EPA聯合順鉑對肺腺癌A-549細胞株的影響及可能的作用機制和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺腺癌A-549細胞株（購自上海百誼生物科技有限公司），EPA，順鉑，噻唑藍（MTT），無支原體胎牛血清，RPMI-1640培養液，TUNEL試劑，胰蛋白酶等。

1.2 細胞培養與分組

細胞實驗培養方法參考文獻[7，8]。①細胞培養：肺腺癌A-549細胞解凍后，用RPMI-1640培養液置于CO2培養箱培養，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。0.4%臺盼藍鑒定細胞活性98%以上時做實驗[9]。②細胞分組：A組：加完全培養液50μL；B組：在A組基礎上加EPA 60μg/mL（B1組）、EPA 80μg/mL（B2組）、EPA 100μg/mL（B3組）、EPA 120μg/mL（B4組）、順鉑30μg/mL（B5組）、順鉑30μg/mL+EPA 60μg/mL（B6組）、順鉑30μg/mL+EPA 80μg/mL（B7組）、順鉑30μg/mL+EPA 100μg/mL（B8組）、順鉑30μg/mL+EPA 120μg/mL（B9組）。各組分別培養并在24、48、72和96h時觀察。

1.3 細胞檢測

①形態學觀察：PBS洗滌，95%乙醇固定，常規HE染色，觀察細胞形態變化[9]。②細胞生長抑制率計算：采用MTT法測定各組細胞的生長抑制情況[10，11]。計算各組細胞生長抑制率及藥物半數抑制濃度（IC50）。③細胞凋亡指數（AI）：細胞用4%多聚甲醛固定后，用TUNEL法檢測各組細胞凋亡情況。隨機選取10個高倍視野，分別計數細胞總數及凋亡細胞數。AI＝凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.4 流式細胞術檢測

取對數生長期細胞，置入培養瓶中，貼壁后分別加入各組藥物，48h后用Annexin V-FITC和溴化丙啶（propidium iodide，PI）后上機檢測。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組A-549細胞形態

光鏡下，A組細胞生長旺盛，核分裂多見，核質染色均勻；B組細胞縮小，核質濃縮，部分細胞凋亡。倒置顯微鏡下，A組細胞貼壁生長良好，透光度佳；B組細胞變小，染色質凝集，透亮度差，貼壁能力差，生長明顯受抑。見圖1～4。

2.2 各組A-549細胞生長抑制率及72h時AI比較

見表1。

2.3 流式細胞檢測

對照組細胞G0/G1期分布多，藥物組出現典型凋亡峰，S期細胞增多，隨藥物劑量的增加及時間延長而增加，提示藥物聯合組細胞受阻于S期。

3 討論

在抗腫瘤藥物作用和細胞凋亡的研究中，多數抗腫瘤藥物作用于腫瘤細胞增殖的不同時期，從而誘導細胞死亡。但是抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，會對正常的組織細胞帶來損傷[12]。

既往的研究提示，EPA能明顯抑制腫瘤的發生、生長和轉移速度，對防治肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和子宮癌等有積極作用，其抗癌的主要機制：抑制起源于花生四烯酸（AA）的花生酸類的生物合成，影響轉錄因子的活性、基因表達、信號的轉錄，增強免疫，脂質過氧化[13-15]，清除自由基，修復損傷的細胞DNA[16]，避免損傷細胞凋亡或突變為腫瘤細胞。順鉑系鉑的金屬絡合物，作用類似于烷化劑，主要作用靶點為細胞DNA，作用于DNA鏈間及鏈內交鏈，形成DDP-DNA復合物，干擾DNA復制或與核蛋白及胞漿蛋白結合，屬于細胞周期非特異性藥物[17，18]。

本研究表明，EPA對肺腺癌A-549細胞具有抑制增殖作用和誘導細胞凋亡作用，在HE染色后光鏡和倒置顯微鏡觀察，添加EPA的實驗組細胞呈現明顯凋亡改變，從形態學上證明了EPA具有誘導細胞凋亡的作用。添加EPA和順鉑的實驗組比單純添加順鉑組抑制A-549細胞的作用更明顯，同時實驗顯示，隨著EPA劑量的增加，其抑制細胞增殖及誘導凋亡作用明顯增強，細胞被阻止在S期，進一步證實了EPA聯合順鉑對A-549細胞的作用呈量效關系，并具有時間依賴性。

總之，在體外實驗中，EPA對人肺腺癌A-549細胞株有生長抑制作用，并呈現時間與量效關系，聯合順鉑對細胞株作用更明顯。其抑制腫瘤細胞機制可能為影響A-549細胞株的轉錄因子活性，聯合順鉑改變A-549細胞株增殖過程中的基因表達，轉錄信號調控，干擾腫瘤細胞的DNA復制等。通過上次[9]和本次實驗，我們認為EPA有望成為新型抗腫瘤藥物，聯合順鉑等傳統抗腫瘤藥物，在序貫治療肺腺癌中很有前景。下一步的研究將主要為EPA聯合其他抗腫瘤藥物作用于肺腺癌A-549細胞株的研究，EPA抗腫瘤作用的最佳劑量以及EPA聯合每一種抗腫瘤藥物的最佳生物結合率等。

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（收稿日期：2011-06-10）