血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑洛沙坦對膿毒癥大鼠多臟器的保護作用

[摘要]目的 探討血管緊張素Ⅱ受體（AT1型）特異性拮抗劑洛沙坦（losartan）對膿毒癥大鼠心、肝、腎、肺、小腸等多臟器的保護作用及對預后的影響。方法 SD清潔級大鼠120只，雌雄不拘，隨機分為4組，即假手術組（30只）、膿毒癥組（30只）和膿毒癥大鼠30mg/kg劑量的洛沙組在制模前預給藥、制模后給藥造成處理組（各30只）。采用改良盲腸結扎穿孔方法（CLP）建立大鼠膿毒癥模型。觀測各組動物心、肝、腎、肺、小腸等臟器功能指標。各組剩15只大鼠計算5d累計死亡率。結果 與假手術組比較，膿毒癥組大鼠心、肝、腎、肺、小腸等功能指標有顯著變化 （P＜0.05），病理損害較嚴重，死亡率顯著升高（P＜0.05）；與膿毒癥組比較，給予洛沙組處理的兩組大鼠心、肝、腎、肺、小腸等功能指標與膿毒癥組比較顯著好轉（P＜0.05），病理損害較輕，死亡率顯著下降（P＜0.05）。兩洛沙坦處理組無明顯差異（P＞0.05）。結論 洛沙坦對膿毒癥大鼠心、肝、腎、肺、小腸等多臟器具有保護作用，并能改善預后。

[關鍵詞] 血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑；洛沙坦；膿毒癥；盲腸結扎穿孔；多臟器保護

[中圖分類號] R631 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）23-20-05

Angiotensin Ⅱ Receptor Antagonist Losartan on Acute Protective Effect of Multiple Organs in Rat with Sepsis

WANG Yao FEI Maoyun FENG Wenming BAO Ying TAO Yulong QIN Lianjin ZHANG Xiaolan JIANG Xiaoying

Institute of Molecular Sugery， The First People’s Hospital of Huzhou City in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To study the role of Angiotensin Ⅱreceptor （AT1-type） antagonist losartan in rat with sepsis on acute protective effect of multiple organs including heart，liver，kidney，lung and intestine. Methods One hundred and Twenty SD rats were randomly divided in to sham operated group（SHAM）， septic group（CLP）， losartan pre-CLP group （pre-CLP） and losartan post-CLP group（pre-CLP）.Each group has 30 rats.Sepsis model was produced by cecalligation and puncture（CLP）. To observe the organ function parameters in all groups of heart，liver，kidney，lung and intestine.Remaining 15 rats in each group calculated the 5d cumulative mortality rate.Results Compared with SHAM group，the organ function parameters of CLP group were significantly abnormal（P＜0.05），pathological damage were more severe， the Mortality rate were significantly increased（P＜0.05）. Compared with CLP group， the organ function parameters of the two losartan groups were Significantly improved （P＜0.05），the Mortality rate were significantly decreased（P＜0.05），and had Less pathological damage. There were no significant difference between pre-CLP group and post-CLP group（P＞0.05）. Conclusion Losartan has acute protective effect of multiple organs in rat with sepsis，and can improve the prognosis in sepsis.

[Key words] Angiotensin Ⅱ receptor antagonist；Losartan；Sepsis；CLP；Multiple organ protection

膿毒癥是嚴重創傷、感染及大手術等應激狀況時常見的并發癥，已成為目前重癥監護病房的首要死亡原因，進一步發展可導致多器官功能障礙綜合征（MODS）[1]。膿毒癥機體組織及細胞可釋放許多炎性介質及細胞因子，這是構成多器官功能損害及衰竭的基本因素，其中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）起了重要作用[2]。血管緊張素Ⅱ受體（AT1型）特異性拮抗劑洛沙坦（losartan）可以阻斷AngⅡ的作用環節，本實驗用洛沙坦處理膿毒癥大鼠，觀察其對各臟器功能的保護作用及其對膿毒癥大鼠預后的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級健康SD雄性大鼠120只，體重270～320g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。隨機分為4組，即假手術組（SHAM）、膿毒癥組（CLP）和洛沙組（30mg/kg）[3]（購自美國Cayman公司）在制模前和制模后給藥造成處理組（Pre-CLP和Post-CLP），各組30只。

1.2 膿毒癥模型建立

采用盲腸結扎穿孔方法建立大鼠膿毒癥模型。參照Wichterman 等[4]的改良盲腸結扎穿孔（CLP） 方法，將盲腸穿孔數由2個增至4個，SHAM組除不施行CLP，其余操作同CLP組。

1.3 心功能檢測指標

各組隨機抽取5只大鼠經右頸總動脈插管至左心室，連接Pclab -3802型生物醫學信號采集系統，觀測制模后6h大鼠平均動脈血壓（MAP）和左心室收縮壓（LVSP）以及心室壓力最大變化速率（±dP/dtmax）。并于制模后6h抽取大鼠靜脈血，采用羅氏2010電化學發光免疫分析儀測定心肌肌鈣蛋白T（cTnT），采用美國貝克曼Beckman 公司生產的CX5全自動生化分析儀， 定量檢測肌酸激酶同工酶MB（CK-MB），試劑盒也由美國貝克曼公司提供。6h后斷頭處死大鼠，取左室心肌組織，常規石蠟切片，在光鏡下觀察并照相。

1.4 肺功能檢測指標

各組再隨機抽取5只大鼠，制模后5.5h按30mg/kg經大鼠尾靜脈注射2%伊文思藍液（EBD，北京恒業中遠化工有限公司）。①伊文思藍含量測定法[5]：制模后6h將動物麻醉開胸取部分左肺，剪去周圍組織，吸干表面水分及血液，稱量濕質量，將肺組織剪成約10mm3小塊浸泡于甲酰胺溶液中（0.2g/kg） ，置60℃恒溫水浴中抽提24h，待組織中色素全部浸出，取出組織，離心，取上清液，在與標準曲線相同的條件下，用紫外分光光度計（島津2000）在620nm波長處進行比色測定光密度值，在標準曲線上查出EB含量，以每克肺組織干重含EB質量表示。②濕/干質量比測定：稱肺組織濕質量后置烤箱80℃，72h，稱干質量，計算濕/干質量比值。為避免EBD影響肺病理切片，將檢測心功能用的各大鼠處死后取左肺組織，常規石蠟切片，在光鏡下觀察并照相。

1.5 腎功能、肝功能及小腸功能檢測指標

各組再抽取5只大鼠，于制模后6h將動物麻醉后活殺，腹主動脈無菌采血，采用美國貝克曼Beckman 公司生產的CX5全自動生化分析儀， 定量檢測血Bun、Cr、Na+及尿Cr、Na+并計算濾過鈉排泄分數FENa[（尿Na+（mol/L）/血清Na+（mol/L）]/[（尿Cr（mmol/L）/血清Cr（mmol/L）]×100%[6]，反映腎功能，同時檢測血ALT、AST、TBIL反映肝功能。各大鼠留取0.5mL血液，并距回盲瓣5cm取回腸組織5cm，采用黎君友等報道的方法測定二胺氧化酶（DAO）含量，并以微量考馬斯亮藍法測定小腸組織蛋白含量，使小腸組織DAO活性以每克蛋白中的量來表示[7]。同時各取腎、肝及末段回腸組織常規石蠟切片，在光鏡下觀察并照相。

1.6 大鼠5d死亡率的計算

各組剩下15只大鼠，分別記錄各實驗動物手術后的自然死亡時間，觀察期共5d，計算5d累計死亡率。

1.7 統計學處理

采用SPSS10.0軟件進行處理，計量資料均數（χ±s）表示，組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，計數資料進行 χ2 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心功能指標

CLP組MAP、LVSP、+dP/dtmax、-dP/-dtmax指標及cTnT、CK-MB指標與SHAM組比較均有顯著差異（P＜0.05）；Pre-CLP組及Post-CLP的MAP、LVSP指標較SHAM組比較顯著下降（P＜0.05），較CLP組顯著升高（P＜0.05）；兩組cTnT、CK-MB指標較SHAM組顯著升高（P＜0.05），較CLP組顯著下降（P＜0.05）；兩組的+dP/dtmax、-dP/-dtmax指標與SHAM組比較無顯著性差異（P＞0.05），較CLP組顯著升高（P＜0.05）。兩處理組之間各項指標差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

2.2 肺功能指標

CLP組的肺濕/干比重及肺微血管通透性較SHAM組有顯著差異（P＜0.05）；Pre-CLP組及Post-CLP組的肺微血管通透性分別為（0.028±0.006）mg/g、（0.027±0.007）mg/g，與SHAM組比較顯著下降（P＜0.05），與CLP組比較顯著升高（P＜0.05），兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。Pre-CLP組及Post-CLP組肺濕/干比重與SHAM組比較無顯著性差異（P＞0.05），與CLP組比較顯著減少（P＜0.05）。兩處理組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表2。

2.3 腎功能指標

SHAM組、CLP組、Pre-CLP組及Post-CLP組大鼠血Cr濃度、血Na+濃度及尿Cr濃度比較無顯著差異（P＞0.05）。CLP組血Bun濃度、尿Na+及濾過鈉排泄分數FENa較SHAM組有顯著差異（P＜0.05）。Pre-CLP組及Post-CLP組的血BUN濃度較CLP組均顯著下降（P＜0.05），與SHAM組無顯著差異（P＞0.05）。Pre-CLP組及Post-CLP組尿Na+濃度及濾過鈉排泄分數FENa較CLP組顯著升高（P＜0.05），較SHAM組顯著下降（P＜0.05）。兩處理組之間各項指標差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表3。

2.4 肝功能指標

CLP組ALT、AST及TBIL指標分別為（128.20±20.75）IU/L、（210.60±38.22）IU/L、（6.34±1.54）μmol/L，較SHAM組均顯著升高（P＜0.05），模型成功。Pre-CLP組及Post-CLP組的三項指標較SHAM組無顯著差異，但較CLP組有顯著下降（P＜0.05）。兩處理組之間三項指標差異無顯著意義（P＞0.05）。 見表4。

2.5 小腸功能指標

CLP組血DAO活性為（1.79±0.37）KU/L，較SHAM組顯著升高（P＜0.05），CLP組小腸組織DAO活性為（2.30±0.48）U/g，較SHAM組顯著下降（P＜0.05）。Pre-CLP組及Post-CLP組的血DAO及活性小腸組織DAO與SHAM組無顯著差異（P＞0.05），但較CLP組有顯著差異（P＜0.05）。兩處理組之間差異無顯著性（P＞0.05）。 見表5。

2.6 死亡率

兩處理組Pre-CLP組和Post-CLP組的死亡率分別46.7%及40.0％，較CLP組均有明顯下降（P＜0.05），兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。見表6。

2.7 各組心、肝、腎、肺、小腸組織的病理變化（圖1）

①光鏡下SHAM組心肌細胞結構正常，心肌纖維束排列整齊，橫紋清晰，心肌間質無水腫；CLP組大鼠心肌纖維部分斷裂、溶解，心肌間質明顯水腫，炎癥細胞浸潤；模前及模后洛沙坦組可見心肌纖維結構完整，間質無明顯水腫，偶見炎癥細胞浸潤。②光鏡下SHAM組肺組織形態正常，CLP組和洛沙坦組均有不同程度的肺水腫、白細胞浸潤、出血和肺不張， CLP組較洛沙坦組肺水腫、白細胞浸潤、出血和肺不張更顯著。③光鏡下SHAM組腎臟未發現組織病理性損傷。CLP組多數動物出現病理性損傷，輕者個別動物可見局灶性腎小管上皮損傷，腎小管內顆粒管型，嚴重者腎組織可見大量炎性細胞浸潤，腎血管廣泛微血栓形成和腎小球毛細血管淤血，腎小管上皮細胞水腫、脫落，有大量顆粒管型。兩洛沙坦組炎性細胞浸潤減輕，腎血管未見明顯微血栓形成和腎小球毛細血管淤血，腎小管呈灶狀損害，上皮細胞水腫、脫落，偶見顆粒管型。④光鏡下SHAM組肝小葉結構完整，肝細胞形態結構正常，肝竇清晰，竇內皮細胞、枯否細胞均未見明顯變化。匯管區小葉間動靜脈、小葉間膽管結構清晰，未見炎細胞。CLP組可見肝細胞明顯腫脹，胞漿疏松，肝小葉結構紊亂，竇腔內可見炎細胞聚集，門脈區有較多炎細胞浸潤，甚至有亞大塊及大塊壞死。兩洛沙坦組肝組織損害較對照組輕。⑤光鏡下SHAM組小腸組織見小腸絨毛有較多嗜酸性白細胞，有少量淋巴細胞浸潤，小腸絨毛少許出血；CLP組小腸絨毛增粗、出血明顯，大量嗜酸性白細胞、淋巴細胞浸潤。兩洛沙坦組小腸絨毛增粗、出血較CLP組輕，嗜酸性白細胞、淋巴細胞浸潤較CLP組少。

3 討論

大鼠CLP模型是目前公認的臨床相關性較強的膿毒癥模型 [8]。血管緊張素原在循環或局部腎素作用下形成血管緊張素Ⅰ（AngI），AngⅠ可被血管緊張素轉化酶（ACE）在內皮細胞內轉化為血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），AngⅡ是腎素-血管緊張素系統（RAS）的主要介質，AngⅡ參與并調節炎癥反應，AngⅡ可部分逆轉內毒素對G蛋白藕聯受體的損傷效應；隨著膿毒癥的發展，循環及局部RAS的高度激活，AngⅡ水平升高，則對組織或器官功能紊亂的過程起維持和加重作用；AngⅡ本身作為炎性介質還可以誘導炎癥反應。膿毒癥機體組織及細胞可釋放許多炎性介質及細胞因子，這是構成多器官功能損害及衰竭的基本因素，AngⅡ起了重要作用[9]。

膿毒癥心肌局部RAS激活，心肌局部AngⅡ釋放增加可能是膿毒癥后心功能障礙的重要因素之一，其機制可能與心肌RAS誘發和加重心肌缺血-再灌注損傷有關。因此使用洛沙坦來拮抗AngⅡ的受體，使其不能發揮作用，膿毒癥后心肌損傷具有明顯的保護作用。MAP、LVSP及+dP/dtmax 是反映心肌收縮功能的敏感指標，而-dP/dtmax 則是反映心肌舒張功能的敏感指標。在本實驗中膿毒癥組出現MAP、LVSP、+dP/dtmax下降，提示膿毒癥狀態存在心肌收縮功能下降，這與Vincent 研究證實膿毒癥狀態下的心功能衰竭與心肌收縮抑制相關[10]是一致的，處理組MAP、LVSP指標較膿毒癥組均有明顯升高，表明洛沙坦對心肌膿毒癥大鼠心肌具有保護作用。cTnT是迄今為止被認為是一種診斷心肌細胞損傷具有高度敏感性和特異性的指標[11]。本實驗觀察到對膿毒癥組的cTnT 6h處較洛沙坦處理組明顯增高，表明洛沙坦能明顯減輕膿毒癥大鼠心肌細胞損傷。CK-MB變化和cTnT相一致，進一步證實了洛沙坦的心肌保護作用。

急性肺水腫是多器官功能障礙綜合征在肺部的表現，其本質是直接或間接損傷肺毛細血管內皮細胞，導致內皮細胞功能障礙及肺毛細血管通透性增高的血管滲漏綜合征。目前已知AngⅡ可通過多種機制影響肺損傷過程，如對肺泡上皮的促凋亡作用，介導肺動脈高壓和纖維化反應等[12]。本實驗洛沙坦處理組肺組織濕/干重比、肺微血管通透性和組織形態學變化均較CLP組顯著好轉，提示應用洛沙坦可減輕肺水腫，改善肺微血管通透性，對肺具有保護作用。

膿毒癥并發急性腎功能衰竭（ARF）的發病機制尚不清楚，細胞因子、低血壓或腎臟灌注不足都可能是其發病環節。RAS參與了腎功能損害的發生和發展。實驗和臨床觀察提示，RAS在急性腎功能衰竭（ARF）中起著重要的作用，是維持腎血管收縮的因素，其促進腎缺血，最終導致ARF。糾正腎臟局部RAS的紊亂對于減輕腎臟損傷具有重要意義，可以避免膿毒癥時器官損傷的發生[6]。本實驗中洛沙坦處理組的腎功能指標血BUN、濾過鈉排泄分數及組織形態學變化均較CLP組有明顯的改善，提示洛沙坦對腎具有保護作用。但血Cr、血Na+等指標無顯著差異，可能與腎功能的代償能力較強，6h尚屬早期有關。

AngⅡ在膿毒血癥引起的肝缺血、缺氧和缺血-再灌注損傷中發揮著關鍵作用[13]。本實驗中CLP大鼠ALT、AST及TBIL升高較明顯，肝組織病理損害清晰，洛沙坦處理組有明顯改善，提示洛沙坦對肝功能亦有明顯的保護作用。

小腸是膿毒癥時最易受損的器官之一，其在膿毒癥的發生、發展過程中有著重要的作用。膿毒癥時可伴發腸黏膜屏障功能不全、腸滲透性增高，Tadros進行實驗觀察發現AngⅡ在膿毒癥所引起腸缺血-再灌注損害中有重要作用[14]。DAO存在于哺乳動物的黏膜或絨毛上層，其中大部分存在于小腸黏膜絨毛。它是具有高度活性的細胞內酶，是反映小腸黏膜結構和功能較為理想的指標[15]。在本實驗中，膿毒癥時血中DAO含量升高，而小腸DAO活性下降，考慮可能是壞死腸黏膜細胞脫落進入腸腔，使小腸組織DAO含量降低。上述結果均提示小腸黏膜屏障功能損傷，洛沙坦處理組則這種變化不明顯，提示洛沙坦對小腸功能有保護作用。兩洛沙坦處理組大鼠的5d累計死亡率均較CLP有顯著降低，提示洛沙坦可改善膿毒癥大鼠的預后。

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（收稿日期：2011-05-11）