丹曲林對糖尿病兔心房重構及氧化應激的影響

[摘要] 目的 本研究旨在探討丹曲林對四氧嘧啶誘導的糖尿病家兔心房肌結構重構及體內氧化應激水平的影響。方法 應用四氧嘧啶成功誘導糖尿病家兔24只，隨機分為糖尿病組和丹曲林干預組，12只正常家兔為對照組，分別測定氧化應激指標一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）及膠原容積分數。 結果 與正常對照組相比，糖尿病組兔的MDA水平明顯升高，SOD 水平有降低趨勢，丹曲林干預組SOD高于糖尿病組，而MDA水平明顯低于糖尿病組，兩組間有統計學差異（P＜0.05），HE及MASSON染色示糖尿病家兔左房肌細胞較正常組排列紊亂，炎癥浸潤，纖維化明顯，而丹曲林干預組炎性改變及纖維化程度均減輕，兩組比較有統計學差異（P＜0.05）。結論 丹曲林干預組體內氧化應激水平及心房肌纖維化程度均較糖尿病組家兔減輕，提示丹曲林能夠拮抗糖尿病家兔氧化應激反應及心房肌纖維化。

[關鍵詞] 糖尿病；丹曲林；心房結構重構；氧化應激

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）35-07-02

The Effect of Dantrolene on the Atrial Structural Remodeling and Oxidative Stress in Alloxan-induced Rabbits

LU Jianhong ZHAI Changlin CHEN Jie

Department of Cardioligy，the First People's Hospital of Tongxiang in Zhejiang Province，Tongxiang 314500 China

[Abstract] Objective To investigate the influence of dantrolene on the level of GSH，SOD，NO，MDA and collagen in left atrium in alloxan-induced rabbit model. Methods Twenty-four alloxan induced diabetic rabbits were divided into two groups（n=12）： Diabetic group（D） and group diabetic rabbits receiving Dantrolene（DR）. 12 normal rabbits were assigned as control group. All animals were measured level of SOD， MDA， NO and GSH and left atrial collagen volume fraction. Results SOD level decreased and MDA level increased in diabetic rabbits group compared with control group（P＜0.05），while in dantrolene group the parameters didn’t have significant difference compared with control group，but they had significant difference compared with diabetes group（P＜0.05）.Masson stained of left atriai tissure showed that LACVF in diabetic rabbits was more higher than normal but in dantrolene group it was decreased（P＜0.05）. Conclusion The study shows that dantrolene may reduces oxidative stress in the diabetic rabbits and inhibits fibrosis process in Left atrium of the diabetic rabbits，and dantrolene may be have potential effect on preventing atrial flatter process.

[Key words] Diabetes；Dantrolene；Fibrosis；Oxiditave stress

心房顫動（AF）為臨床常見的心律失常之一，易導致中風、心律衰竭、慢性疲勞綜合征等，心房重構是房顫發生和維持的重要機制，糖尿病是AF發生的獨立危險因素[1]。目前的研究表明房顫時心房肌細胞內鈣超載對心房發生結構重構及電生理重構起重要作用。丹曲林（dantrolene）在臨床上主要適用于治療惡性高熱病，是細胞內質網上鈣通道受體的拮抗劑，可降低細胞質內過高的游離鈣離子濃度，減輕鈣超載。有研究表明，丹曲林可通過改變大鼠心肌糖代謝酶活性，保護大鼠缺血再灌注心臟的功能[2]。目前，國內外尚無評價丹曲林干預糖尿病兔心房結構重構的報道。本研究旨在建立四氧嘧啶誘導的兔糖尿病模型評價丹曲林對糖尿病兔心房結構重構的干預作用及評價其對家兔機體氧化應激水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組

成年健康家兔36只，體重1.5～2.0kg，雌雄不限，浙江大學醫學院動物室提供，采用隨機數字表法，將其隨機分為三組： 對照組（C組）、糖尿病組（D組）及丹曲林干預組（DR組），每組12只。

1.2 造模和丹曲林處理

D及DR組共計24只以四氧嘧啶120mg/kg經耳靜脈注射造模。經測定注射48h及1周后檢測空腹血糖，兩次空腹血糖≥11.0mmol/L認為造模成功。實驗家兔在清潔條件下喂養飼料80g/d。其中丹曲林干預組每只家兔予丹曲林2mg/48h靜脈注射，共4周，每周固定時間測定體重及空腹血糖，4周后抽取耳靜脈血行血清胰島素及氧化應激指標測定并處死剪取左房標本行組織學檢查及測定左房膠原容積分數（LACVF）。

1.3 試劑

超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒（MDA）、血清胰島素測定試劑盒均購自上海凱云科技有限公司，制造糖尿病家兔模型用四氧嘧啶購自上海華藍化學技術有限公司，試驗用注射丹曲林為輝瑞公司生產，快速測定血糖儀及試紙為瑞典Medi-smart公司生產。

1.4 取材和標本制備

所有家兔喂養4周后，處死取左房標本固定于10%中性福爾馬林液中，24h后行石蠟包埋、切片（4～5cm），分別行蘇木素-伊紅染色（HE）及MASSON染色并測定左房膠原容積分數。

1.5 組織學檢查

所有家兔心房肌標本行HE染色，光鏡下觀察心房肌一般組織特別是心肌橫截面，全部心房肌標本行MASSON染色并測定左房膠原容積分數。

1.6 氧化應激指標測定

所有家兔取耳緣靜脈血3mL， 以4000轉超速離心后取血清于-80℃冰箱保存。統一檢測血清氧化應激指標和血清胰島素水平。

1.7 統計學處理

計量資料采用（χ±s）表示，并進行正態性及方差齊性檢驗，多組均數比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；計數資料采用χ2檢驗， P＜0.05為差異有統計學意義，上述統計學處理采用SPSS11.5統計軟件完成。

2 結果

2.1 糖尿病家兔血清氧化應激指標的變化

由表1可知，各組數據均符合正態性及方差齊性檢驗，D組家兔SOD水平明顯低于C組（F=2.52，P＞0.05，總體方差相等；ν=33，Dunnett-t=3.17，P＜0.05），而MDA水平明顯高于C組（F=1.92，P＞0.05，總體方差相等；Dunnett-t=4.26，P＜0.05），DR組SOD及MDA水平與對照組無明顯差別（F=2.12，Dunnett-t=2.03；F=2.55，Dunnett-t=1.96，P＞0.05），D組家兔的血清SOD水平明顯低于DR組，而MDA水平明顯高于DR組（F=2.62，Dunnett-t=3.28；F=2.03，Dunnett-t=2.86，P＜0.05），但是GSH和NO水平三組間均無統計學差異（F=2.51，1.98，P＞0.05）。

2.2 糖尿病家兔左房心肌組織學結構及纖維化指標的變化

與正常對照組相比，D組兔左房心肌組織HE染色顯示心肌細胞排列方向呈無規則變化，并伴有大量炎癥細胞的浸潤，而DR組心肌細胞排列紊亂明顯減輕（封三圖1）。D組家兔左房心肌組織MASSON染色顯示左心房肌間質顯著纖維化表現，膠原容積分數顯著增加（P＜0.01）（封三圖2），而DR組左房心肌間質纖維化程度明顯減輕，測得膠原容積分數明顯低于糖尿病組（封三圖2），兩組比較有統計學差異（P＜0.05），見表1。

3 討論

本研究采用兔作為糖尿病動物模型，在給藥干預、取血、抗病性等方面明顯優于大鼠。經典的四氧嘧啶誘導法[3]相比其他藥物具有建模成功率高、作用溫和、對其他組織的毒性相對較小的優點。血清學檢測指標與病理檢測結果發現，與正常家兔比較，糖尿病家兔血清的氧化應激指標水平明顯增高，左房心肌重構明顯，纖維化加重，而丹曲林則可降低糖尿病家兔的氧化應激水平和心房肌纖維化程度，而丹曲林對糖尿病兔的空腹血糖及胰島素水平未見明顯的影響。

房顫是臨床上最常見的心律失常，而糖尿病是房顫發生的危險因素之一。近年來的研究顯示炎癥介導的氧化應激在AF的發生發展中占據著重要的地位[4，5]，臨床研究也表明他汀類藥物、血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEIs）及血管緊張素受體拮抗劑（ARBs）、糖皮質激素、多不飽和脂肪酸及維生素C等具有潛在抗炎及抗氧化作用的藥物對于AF有一定的預防和治療作用[6，7]。糖尿病引起的AF機制目前尚不明確，Kato等[8]的研究表明糖尿病能夠導致心房結構性重構、延長房間傳導時間以及增加AF的發生率。

結構重構是房顫自我穩定的機制之一，動物實驗發現心房纖維化造成可誘發房顫的持續[9]。各種因素引起的心房肌細胞內鈣超載對心房發生結構重構及電生理重構起重要作用。目前關于丹曲林對AF預防作用的臨床研究尚少，Yu G等[10]研究發現丹曲林可保護大鼠缺血再灌注心臟的功能，王麗艷[2]等研究發現丹曲林能夠影響缺血再灌注大鼠心肌糖代謝酶活性，增加冠脈流量，對缺血再灌注的心肌有保護作用。

本實驗中，D組家兔和DR組家兔的血糖水平未降低，可能是經四氧嘧啶誘導的糖尿病家兔胰島素分泌功能不足引起，因其增加了胰島素敏感性，從而使兩組胰島素水平都有下降。MDA、GSH、SOD以及NO反映氧化應激的水平，本實驗中測得與C相比，D組兔的MDA水平明顯升高，SOD水平有降低趨勢，DR組SOD高于D組，而MDA水平明顯低于D組，而GSH 和 NO水平三組無差異，本試驗丹曲林對NO和GSH未產生影響可能與觀察時間不足有關。HE及MASSON染色示糖尿病家兔左房肌細胞較正常組排列紊亂，炎癥浸潤，纖維化明顯，而DR組炎性改變及纖維化程度均減輕，兩組比較有統計學差異。

綜上所述，我們的實驗結果表明與糖尿病家兔組相比，丹曲林能夠減輕家兔左房結構重構變化，推測其在AF的發生發展中可能起到了一定的保護作用，那么該類藥物是否能夠逆轉糖尿病兔心房的電重構以及具體的分子機制，還需進一步深入研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2011-09-01）