氯沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞結(jié)締組織生長因子及E鈣黏蛋白表達(dá)作用研究

摘 要 目的：探討氯沙坦對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞株NRK-52E結(jié)締組織生長因子（CTGF）抑制作用。方法：作用72小時(shí)后，Western blot檢測空白組（0mmol/L葡萄糖）、正常葡萄糖組（5mmol/L葡萄糖）、高糖干預(yù)組（25nmol/L葡萄糖）、氯沙坦干預(yù)組（10nmol/L氯沙坦）、氯沙坦高糖干預(yù)組（10nmol/L氯沙坦預(yù)處理后在高糖培養(yǎng)）中CTGF及E鈣黏蛋白在NRK-52E細(xì)胞表達(dá)。細(xì)胞ROS含量應(yīng)用CM2H2DCFDA試劑盒檢測。結(jié)果：高濃度葡萄糖上調(diào)CTGF表達(dá)，下調(diào)E鈣黏蛋白表達(dá)，ROS含量顯著上升。應(yīng)用氯沙坦干預(yù)后可以下調(diào)高糖CTGF表達(dá)，上調(diào)E鈣黏蛋白表達(dá)、細(xì)胞ROS含量下降。結(jié)論：氯沙坦可抑制高糖誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞CTGF表達(dá)。

關(guān)鍵詞 高糖NRK-52E細(xì)胞 結(jié)締組織生長因子 氯沙坦

結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是即刻早期基因CCN家族的成員之一。CTGF與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附遷移、促進(jìn)有絲分裂的發(fā)生、細(xì)胞活化和參與血管的生成。CTGF的表達(dá)水平與糖尿病多種組織纖維化的發(fā)生進(jìn)展、血管生成及其預(yù)后密切關(guān)聯(lián)^［1～4］。E鈣黏蛋白作為常見調(diào)控細(xì)胞間黏附能力的調(diào)控因子，直接參與著腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是糖尿病腎病纖維化重要病理基礎(chǔ)。目前發(fā)現(xiàn)高糖主要通過誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)從而對(duì)腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞促進(jìn)其轉(zhuǎn)分化為纖維化細(xì)胞的作用^［5］。但血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑作為糖尿病腎病首選藥物，對(duì)在不同狀態(tài)葡萄糖的條件下轉(zhuǎn)分化作用如何，有待于深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)將觀察不同條件葡萄糖狀態(tài)及氯沙坦干預(yù)下大鼠腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞株NRK-52E中CTGF及E鈣黏蛋白表達(dá)，同時(shí)觀察NRK-52E細(xì)胞ROS含量情況，以闡明氯沙坦對(duì)不同葡萄糖條件對(duì)腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞CTGF及E鈣黏蛋白的影響。

資料與方法

細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞株NRK-52E購自中科院細(xì)胞庫，培養(yǎng)基配備為DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司）基本配備為含加入10ml進(jìn)口胎牛血清（Sigma，USA）、1ml雙抗（青、鏈霉素各100U/ml）、1mmol/L EDTA。每周傳代2～3次。

實(shí)驗(yàn)分組與處理：分組為：①空白對(duì)照組（control）：無糖培養(yǎng)基未進(jìn)行干預(yù)。②正常葡萄糖組（5MM glu）：含5mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。③高糖組（25MM glu）含25mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。④氯沙坦干預(yù)組（Losartan）：無糖培養(yǎng)基應(yīng)用10nmol/L氯沙坦（購置于Sigma公司）干預(yù)。⑤氯沙坦高糖干預(yù)組（Losartan+25MM glu）：經(jīng)應(yīng)用10nmol/L氯沙坦預(yù)處理3天后，含25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有分組均在37℃，5% CO₂條件下培養(yǎng)72小時(shí)。

Western blot檢測蛋白表達(dá)：進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞裂解獲取蛋白后，與預(yù)染蛋白marker一起上樣，經(jīng)分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電離，完畢后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，將膜放入含100g/L脫脂奶粉的TBST中封閉，4℃過夜，然后與一抗（CTGF及E鈣黏蛋白均購置美國Santa cruz公司）分別按1:75的比例孵育室溫90分鐘，用TBST液洗膜5分鐘，洗3次，PVDF膜別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1:1000）室溫孵育45分鐘后，用TBST液洗膜3次，每次5分鐘。用ECL顯色試劑盒顯示目的條帶。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法：所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，Western blot圖片檢測采用Gel.Doc-It imaging system掃描分析儀掃描凝膠圖譜，采用Total Lab分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行密度掃描分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用One-Way ANOVA-SNK法比較總體和組間差異。

結(jié) 果

不同葡萄糖狀態(tài)及氯沙坦干預(yù)條件誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞株中各種轉(zhuǎn)分化標(biāo)記物表達(dá)影響，Westernblot結(jié)果應(yīng)用圖片分析軟件分析各組凝膠密度后，提示對(duì)比空白組及正常葡萄糖組，高糖能顯著上調(diào)CTGF表達(dá)（P值均＜0.01）、下調(diào)E鈣黏蛋白表達(dá)（P值均＜0.01）。應(yīng)用氯沙坦預(yù)處理后，高糖組CTGF表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）、E鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。

不同條件下誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞株ROS含量影響結(jié)果提示高糖能顯著促進(jìn)ROS含量水平升高。氯沙坦能顯著降低高糖的ROS含量（P值均＜0.01）。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度葡萄糖分別作用72小時(shí)后，高糖組CTGF表達(dá)顯著高于正常葡萄糖及空白對(duì)照組、E鈣黏蛋白低于正常葡萄糖組及對(duì)照組（P＜0.01）。CTGF及E鈣黏蛋白在腎臟纖維化形成過程中的作用機(jī)制已經(jīng)得到了深入的研究，認(rèn)為可以促進(jìn)轉(zhuǎn)分化因子-β₁表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為含α-平滑肌激動(dòng)蛋白（α-SMA）細(xì)胞^［6］。故此，本研究中CTGF表達(dá)在高糖狀態(tài)表達(dá)上調(diào)，E鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)提示高糖可通過CTGF作用抑制E鈣黏蛋白表達(dá)，從而顯著促進(jìn)NRK-52E轉(zhuǎn)分化。而經(jīng)過氯沙坦干預(yù)處理后，高糖中NRK-52E細(xì)胞CTGF表達(dá)下調(diào)，結(jié)合Ren等研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑Irbesartan能顯著抑制CTGF及α-SMA表達(dá)，說明氯沙坦可能具有抑制NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用。

為進(jìn)一步闡明高糖對(duì)于腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用影響，本研究將觀察在不同葡萄糖條件及氯沙坦干預(yù)NRK-52E細(xì)胞株ROS含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖NRK-52E細(xì)胞ROS含量均顯著升高，但應(yīng)用氯沙坦干預(yù)后能顯著降低ROS含量，也進(jìn)一步證實(shí)了氯沙坦同樣具有抗氧化作用，是NRK-52E細(xì)胞免于轉(zhuǎn)分化的主要保護(hù)因素。

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